 試驗設(shè)計 微膠囊的制備：以海藻酸鈉、乳清蛋白為壁材，采用擠壓法制備微膠囊，具體方法如下： 將雙歧桿菌接種MRS液體培養(yǎng)基，于37℃厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次后，離心(5000 r/min, 5 min)收集菌泥，用 0.9%生理鹽水洗滌兩次后，重懸于生理鹽水中，使得濃縮菌液維持在109 CFU/mL，采用傾注平板法對濃縮菌液進(jìn)行計數(shù)。取一定量的濃縮菌液，加入凍干保護(hù)劑，與2%海藻酸鈉和10%的乳清蛋白按1：1：1 比例混勻成菌懸液，磁力攪拌30 min。采用1mL 注射器逐滴加入2%的氯化鈣中，靜置30 min，生理鹽水洗滌3次，得濕膠囊，將樣品在-80℃中預(yù)凍1 h后，于冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，得凍干微膠囊。在濃縮菌液中，加入等量保護(hù)劑直接冷凍干燥后，得凍干菌粉。 含低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的設(shè)計： 單因素試驗：低聚木糖添加量的篩選：分別按照濃縮菌液的0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%加入低聚木糖，充分混勻后進(jìn)行制備凍干微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 甘油添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的甘油于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 谷氨酸鈉添加量的篩選：在最佳低聚木糖含量的基礎(chǔ)上，分別加入0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的谷氨酸鈉于濃縮菌液中，充分混勻后制備微膠囊，并測定其包埋率、凍干存活率和最終活菌載率。 正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按表1進(jìn)行正交試驗，以雙歧桿菌最終活菌載率為考察指標(biāo)，確定復(fù)配保護(hù)劑的最佳配比。
包埋率、凍干存活率和最終活菌載率計算：取1 g 濕(凍干)微膠囊于錐形瓶中，加入10 mL無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37℃振蕩1 h，用0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋, 使用傾注平板法進(jìn)行精確計數(shù)。包埋率、凍干存活率以及最終活菌載率計算公式如下：
式中N0:原菌懸液總的活菌數(shù)(CFU)；N1:濕膠囊中總的活菌數(shù)(CFU)，每克濕膠囊中的活菌量乘以總的濕膠囊質(zhì)量；N2:凍干微膠囊中總的活菌數(shù)(CFU) ，每克凍干膠囊中的活菌量乘以總的凍干膠囊質(zhì)量。 微膠囊的掃描電子顯微鏡分析：用JSM-6490LV儀器拍攝雙歧桿菌微膠囊掃描電子顯微照片，以未添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊為對照。 微膠囊在模擬胃液中的耐酸試驗：模擬胃液配制：將8.5 g的NaCl和3.0 g的胃蛋白酶懸浮在7.0 mL的濃HCl中，并用蒸餾水稀釋至1 L，使得溶液pH為2.0。分別取1 g添加保護(hù)劑和未添加保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，并加入10 mL的模擬胃液，于37℃下振蕩2 h，分別在0、10、30 min、1、2 h 取樣離心(5000 r/min,5 min)收集微膠囊，并加入10 mL的無菌PBS緩沖液（pH=7.4），于37℃下振蕩1 h, 使用傾注平板法進(jìn)行精確計數(shù)，以初始微膠囊中的活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計算其存活率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗：模擬腸液的配制：取6.8 g的KH2PO4和10 g的胰蛋白酶溶于適量的蒸餾水中，用1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.5±0.1后，稀釋至1 L備用。分別取1 g添加及未添加冷凍保護(hù)劑的微膠囊置于錐形瓶中，隨后加入10 mL的模擬腸液，于37℃恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)3 h，依次在20、40 min、1、2、3 h 取樣，使用傾注平板法進(jìn)行精確計數(shù)，以最大活菌釋放量為基準(zhǔn)，計算其釋放率，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。 微膠囊貯存穩(wěn)定性試驗：將添加及未添加保護(hù)劑的凍干微膠囊分別在4℃和25℃下避光貯存35 d，每隔7 d取1 g樣品，加入10 mL的無菌PBS緩沖液，于37℃下振蕩1 h，使用傾注平板法測定雙歧桿菌活菌數(shù)，其中以雙歧桿菌凍干菌粉為對照。 試驗結(jié)果 （1）單因素實驗結(jié)果 低聚木糖添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖1所示，在一定范圍內(nèi)，低聚木糖可以顯著提高微膠囊的活菌載率，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時，達(dá)到最大，為63.4%。適量的低聚木糖加入可以同時提高微膠囊的包埋效果和雙歧桿菌的抗凍性；然而當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿砍^4%時，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低；因此選擇2%~6%的低聚木糖添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗。
甘油添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖2所示，保持低聚木糖添加量為4%，隨著甘油量的增加，微膠囊的活菌載率先增高后降低，在添加量為2%時，達(dá)到最大值，為67.5%；但過多甘油加入，會使得微膠囊的包埋效果降低，從而減少微膠囊的最終活菌載率；因此選擇1%~3%的甘油添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗。
谷氨酸鈉添加量對凍干微膠囊活菌載率的影響 如圖3所示，保持低聚木糖添加量為4%，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為1%時，谷氨酸鈉可以顯著增強(qiáng)微膠囊的活菌載率；但過多的谷氨酸鈉會導(dǎo)致單位質(zhì)量微膠囊中菌含量減少，降低微膠囊的包埋率，同時谷氨酸鈉濃度過高也會造成胞內(nèi)滲透壓增加，不利于低溫保存。因此，當(dāng)繼續(xù)增加谷氨酸鈉時，微膠囊的最終活菌載率逐漸降低；因此為進(jìn)一步研究谷氨酸鈉在復(fù)配保護(hù)劑中的協(xié)同效果，選擇1%~3%的谷氨酸鈉添加量進(jìn)行后續(xù)正交試驗。
（2）正交試驗結(jié)果 由表2和表3可知，影響微膠囊最終活菌量的因素主要次序是低聚木糖＞谷氨酸鈉＞甘油，其中低聚木糖的P值小于0.05，說明低聚木糖含量對微膠囊的最終活菌載量具有顯著性影響。根據(jù)K值，確定最佳配方為A2B2C1，即低聚木糖4.0%，甘油2.0%，谷氨酸鈉1.0%。經(jīng)驗證，最佳配方下的雙歧桿菌微膠囊包埋率81.5%±0.7%，凍干存活率為88.1%±0.3%。 此時微膠囊的最終活菌負(fù)載率為71.8%±0.2%，優(yōu)于正交試驗表中的結(jié)果，因此認(rèn)為正交試驗優(yōu)化結(jié)果有效。
（3）微膠囊的表觀形態(tài)分析 如圖4所示，微膠囊粒徑大小約為1 mm左右，表面呈皺縮塌陷，凹凸不平的現(xiàn)象。添加4%低聚木糖保護(hù)劑的微膠囊（圖 b）相對于對照組（圖 a），表面孔徑較少，沒有明顯的裂縫。由于復(fù)配保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果更佳，可以更有效的減緩凍干過程中冰晶的升華，因此添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊（圖 c）更加圓潤包滿，且表面平整致密。
（4）微膠囊在模擬胃液中的耐酸性能 如圖5所示，未包埋的益生菌粉經(jīng)模擬胃液處理2 h后，菌體幾乎全部死亡，而經(jīng)包埋的益生菌下降了49.4%，說明益生菌微膠囊化可以有效抵抗胃酸等不良環(huán)境。此外，添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊經(jīng)模擬胃液處理2 h后，其活菌數(shù)只下降了34.1%，說明保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的耐酸性。此外，谷氨酸鈉的添加也會誘導(dǎo)某些與菌體生物膜及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生改變, 從而有利于在在酸性環(huán)境中生存。
（5）微膠囊在模擬腸液中的釋放性能 如圖6所示，經(jīng)包埋的益生菌微膠囊具有一定緩釋作用，在60 min幾乎全部釋放，其活菌數(shù)約108 CFU/mL，其中添加含低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊在前60 min的釋放量高于未添加的微膠囊；原因可能是添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊，活菌載量更高，而且低聚木糖作為功能性益生元，可以充當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)刺激促進(jìn)雙歧桿菌的生長。因此添加復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊能夠較好地在人工腸液中崩解，并且達(dá)到益生元和益生菌的協(xié)同作用。
（6）微膠囊的儲存性能 由圖7和圖8可知，在4℃和25℃貯藏一定時間后，經(jīng)微膠囊化的益生菌存活率顯著高于凍干菌粉(P＜0.05)，說明微膠囊技術(shù)提高了雙歧桿菌的儲存穩(wěn)定性。微膠囊壁材可以作為物理屏障，阻隔空氣中氧和水分等不良因素，增強(qiáng)雙歧桿菌的抵抗能力。添加低聚木糖復(fù)配劑的微膠囊，在4℃和25℃下貯藏35 d后，活菌量分別為8.1和7.0 lg CFU/g，相對未添加保護(hù)劑的微膠囊儲藏性更好，且符合《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定(試行)》，原因可能是復(fù)配保護(hù)劑中低聚木糖和谷氨酸鈉具有一定還原性，可以更有效減少菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化, 維持雙歧桿菌的穩(wěn)定性。
試驗結(jié)論 以海藻酸鈉和乳清蛋白為壁材制備的雙歧桿菌微膠囊中，添加以低聚木糖復(fù)配的凍干保護(hù)劑可以提高凍干微膠囊的活菌載率，最佳配方為低聚木糖4.0%、甘油2.0%、谷氨酸鈉1.0%，此時微膠囊的活菌載率為 71.8%±0.2%，與未添加組相比提高了約 21.6%；添加以低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑的微膠囊表面更佳平整致密，經(jīng)模擬胃液處理2 h 后，活菌量相對于對照組提高了約15.3%，同時在腸液中前60 min的釋放率也顯著高于未添加組。經(jīng) 4℃和25℃儲藏35 d后, 加入保護(hù)劑的微膠囊活菌量相比與未添加組分別提高了約0.41 lg CFU/g和0.42 lg CFU/g。因此，低聚木糖復(fù)配保護(hù)劑可以提高雙歧桿菌微膠囊的胃液耐酸性、腸液釋放性和儲藏穩(wěn)定性。
參考資料： 張傳偉,朱慧霞,柴佳太,彭洪草,姚日生.低聚木糖復(fù)配凍干保護(hù)劑的優(yōu)化及其對雙歧桿菌微膠囊性能的影響[J/OL].食品工業(yè)科技:1-13. |
