試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇24只雄性無特定病原體的（SPF）C57BL/6NTac（B6）小鼠（Taconic）作為研究對(duì)象，小鼠被分為2組，飼養(yǎng)在我們的動(dòng)物設(shè)施中，每個(gè)籠子6只小鼠。實(shí)驗(yàn)組從3周齡開始，以多糖為基質(zhì)，自由飲食補(bǔ)充有10% XOS的Altromin C1000鼠糧，對(duì)照組則是自由飲食不添加任何補(bǔ)充物的Altromin C1000鼠糧；在喂食XOS飲食10周后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重；在11周齡時(shí)，從每只小鼠中采集20 mL全血，從臉頰上的頸靜脈交界處提取RNA；所有小鼠在13周齡時(shí)都被麻醉，然后用頸椎脫位法處死；小鼠被處死后，收集糞便和盲腸內(nèi)容物并儲(chǔ)存在-80°C，直到提取DNA，并通過qPCR進(jìn)行細(xì)菌圖譜分析，和基因表達(dá)分析。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）膳食XOS增加了整個(gè)小鼠腸道的雙歧桿菌屬 如表1所示，未發(fā)現(xiàn)XOS飲食對(duì)任何消化道節(jié)段的擬桿菌門有顯著的影響，喂食XOS小鼠的盲腸內(nèi)容物中厚壁菌門的細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照組喂養(yǎng)的小鼠高1.3倍（P<0.01）；乳酸菌，屬于厚壁菌門中的一個(gè)屬，在喂食XOS小鼠的盲腸中含量明顯比對(duì)照組高5.2倍（P< 0.05）。此外，在所有測(cè)試的腸道切片中，喂食XOS小鼠的雙歧桿菌數(shù)量都有顯著增加（P<0.01），且盲腸內(nèi)容物中的雙歧桿菌含量高出對(duì)照組47倍。 如圖1所示，在喂食XOS后，回腸中雙歧桿菌的比例最高；在對(duì)照組中，雙歧桿菌和乳酸菌都占十二指腸總微生物群的3%；在回腸中分別占8%和15%；在大腸中，這些菌屬的比例不超過0.5%。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明XOS不僅在結(jié)腸和盲腸中發(fā)酵，而且在小腸中也對(duì)微生物群產(chǎn)生了影響。 為了消除體重這一可能的混雜因素，在小鼠10周齡時(shí)對(duì)其進(jìn)行稱重，沒有觀察到體重的差異；XOS組的體重為25.3±0.3克，對(duì)照組的體重為24.5±0.4克。
（2）膳食XOS誘導(dǎo)了抗菌蛋白R(shí)egIIIγ的局部表達(dá) 如圖2A所示，與對(duì)照組小鼠相比，喂食XOS的小鼠十二指腸和回腸IECs中的RegIIIγ都顯著被上調(diào)了（P<0.01）（圖2A）。如圖2B所示，編碼GPR43受體的Ffar2的基因表達(dá)也在小腸和大腸的腸細(xì)胞中進(jìn)行了分析。在mRNA水平上，XOS組和對(duì)照組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異，表明該受體的從頭合成不受XOS飲食的影響。如圖2C所示，為了研究IECs的局部先天免疫反應(yīng)，分析了Tnf、Il18、Cxcl1和Cxcl2在小腸和大腸的腸細(xì)胞中的表達(dá)；編碼角化細(xì)胞源性趨化因子（KC）的Cxcl1的表達(dá)，是小鼠吸引中性粒細(xì)胞的重要趨化因子，與未處理組相比，XOS組中從十二指腸分離的IECs顯著增加（P<0.05），而兩組間回腸的表達(dá)無差異。與對(duì)照組相比，XOS喂養(yǎng)小鼠的所有腸細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-18以及趨化因子CXCL2（巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2）的mRNA水平都不受影響。 如圖3所示，XOS組回腸上皮細(xì)胞中Slc9a3的表達(dá)往往大于對(duì)照組（P=0.06），這僅僅表明喂食XOS小鼠的小腸對(duì)SCFAs的吸收增加。
（3）在喂食XOS的小鼠中，免疫相關(guān)基因的系統(tǒng)性表達(dá)發(fā)生了變化 如圖4A所示，為了證明XOS可能具有的系統(tǒng)性抗炎作用，我們?cè)?0周齡時(shí)測(cè)量了全血中Il1β的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)XOS組的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。一些細(xì)胞因子，包括1型和2型IFN，刺激中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，IL-18刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生了IFN-γ；如圖4B所示，為了評(píng)估這種刺激是否也受到XOS干預(yù)的影響，測(cè)定了Ifnγ的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XOS組小鼠的全血中Ifnγ的表達(dá)顯著少于對(duì)照小鼠（P<0.05）；如圖4C和4D所示，全血中IL-18和Ffar2的表達(dá)量在XOS組比對(duì)照組更大，但組間差異不明顯（分別為P=0.05和P=0.09）。 如圖5A所示，發(fā)現(xiàn)Il1β和Ffar2的表達(dá)被5-10 mmol/L的丙酸以劑量依賴的方式下調(diào)，而用乙酸處理與未處理的樣品沒有明顯的差異（P=0.28）。如圖5B和5D所示，與處理過的樣品相比，在血液中加入丙酸后，Ifnγ和Il18的表達(dá)被下調(diào)；然而僅在加入10 mmol/L丙酸后，Il18的表達(dá)才與未處理的樣品有顯著差異（P<0.01）。
（4）補(bǔ)充XOS的飲食減少了促炎細(xì)胞因子的局部產(chǎn)生 為了研究XOS飲食的局部和全身適應(yīng)性免疫反應(yīng)，特別是IFN-γ，在XOS處理后在血液中的表達(dá)減少，從脾臟和MLN中分離出細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。與對(duì)照組小鼠（所有CD4+T細(xì)胞為1.8±0.2%）相比，XOS喂養(yǎng)的小鼠MLN中產(chǎn)生IFNγ的T細(xì)胞比例較低（P<0.01），這表明對(duì)這種促炎細(xì)胞因子有局部下調(diào)作用；研究了雙歧因子XOS處理對(duì)產(chǎn)生IL-10的Treg細(xì)胞的抗炎作用，然而在MLNs或脾臟的抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生方面，兩組之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異；對(duì)于FoxP3+ Treg細(xì)胞和已知可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的耐受性CD103+ DCs的水平也得到了類似的結(jié)果，這表明雙歧桿菌比例的增加沒有直接接觸和影響這些調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞區(qū)間。 試驗(yàn)結(jié)論 本研究表明雙歧因子XOS不僅在結(jié)腸而且在整個(gè)小腸中也增加了雙歧桿菌的數(shù)量；防御素再生胰島衍生蛋白3γ（RegIIIγ）的上調(diào)可能是作為一種保護(hù)，防止細(xì)菌與粘膜屏障之間相互作用的增加。因此，XOS分解發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs可能是血液中觀察到的IL-1β和其他促炎細(xì)胞因子表達(dá)減少的間接原因。
參考資料： Hansen C H F , Hanne Fr?ki?r, Christensen A G , et al. Dietary Xylooligosaccharide Downregulates IFN-γ and the Low-Grade Inflammatory Cytokine IL-1β Systemically in Mice[J]. Journal of Nutrition, 2013, 143(4):533-540. |
