試驗(yàn)設(shè)計(jì) 原料：乳清濃縮蛋白WPC 80，蛋白質(zhì)含量≥80%；低聚木糖，低聚木糖含量95%。 實(shí)驗(yàn)方法：分別稱取不同質(zhì)量的低聚木糖與乳清蛋白混合，用去離子水將其溶解，使得乳清蛋白質(zhì)量濃度為120 g/ L，低聚木糖的最終質(zhì)量濃度分別為10、30、60、90、120 g/L，室溫下磁力攪拌2 h，得到混合溶液；再用2.5 mol/L的NaHCO3將溶液pH調(diào)節(jié)為8.0，保鮮膜封口，于85℃恒溫水浴鍋中加熱2.5 h，期間分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí)取樣，用冷水迅速降至室溫，凍干得糖基化乳清蛋白（GWP）粉末。 以接枝度確定糖基化時(shí)間制得糖基化乳清蛋白，通過紅外光譜圖分析其二級結(jié)構(gòu)變化，再探究低聚木糖添加量對糖基化乳清蛋白的凝膠色差、持水性、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)及流變性質(zhì)的影響。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）接枝度分析 由圖1可知，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，不同低聚木糖添加量下的GWP接枝度持續(xù)增加，其中低聚木糖添加量為1%的GWP接枝度在2 h時(shí)達(dá)到最高，隨著反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長，接枝度降低；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到2 h時(shí)，GWP接枝度隨低聚木糖添加量的增加而升高，添加6%低聚木糖時(shí)，GWP接枝度達(dá)到（14.73±0.67）%，高于其他樣品組，但當(dāng)?shù)途勰咎抢^續(xù)添加時(shí)，接枝度開始降低，此外，GWP的接枝度在2 h之后隨時(shí)間的延長增加幅度減小，說明時(shí)間對其影響程度減弱，為避免持續(xù)加熱可能會(huì)對糖基化蛋白的風(fēng)味及色澤造成不良影響，所以后續(xù)糖基化乳清蛋白的制備時(shí)間選擇濕熱處理2 h。
（2）FTIR分析 由圖2可知，在3700~3200 cm-1處，相較于WPC而言，GWP的頻帶變寬且光譜的譜帶強(qiáng)度出現(xiàn)變化，這是由于低聚木糖糖鏈上含有大量-OH，在糖基化反應(yīng)發(fā)生后，肽鏈接入糖鏈，羥基數(shù)量增加，而-OH在3500 cm-1左右處具有伸縮震動(dòng)，且大約在3300 cm-1處有-NH 的彎曲震動(dòng)，-OH的伸縮震動(dòng)及-NH的彎曲震動(dòng)引起了光譜圖的改變，由此說明蛋白質(zhì)上的氨基參與了反應(yīng)，形成酰胺；此外，羥基在1200~1000 cm-1處具有特征吸收峰，而GWP在1020 cm-1左右處較WPC有更強(qiáng)的吸收峰，進(jìn)一步說明糖基化反應(yīng)引入了大量-OH，此外，-CH在 3000 cm-1左右處反不對稱的拉伸振動(dòng)則說明了糖鏈的共價(jià)接入；通過對乳清蛋白糖基化前后的紅外光譜分析可知，糖基化反應(yīng)引入了大量羥基，改變了蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)。
（3）凝膠色差分析 由表1可知，GWP凝膠的L*亮度值受低聚木糖添加量的影響顯著（P<0.05），在所研究的濃度區(qū)間內(nèi)，各GWP凝膠與黃油的L*亮度值均在85.00至90.00之間；各GWP樣品之間的a*紅度值差異不顯著（P>0.05）；GWP凝膠的b*黃度值較WPC凝膠顯著增加（P<0.05），此外，b*黃度值是影響GWP表觀色澤的主要參數(shù)，各GWP凝膠的b*黃度值處于WPC與黃油之間，表明在本試驗(yàn)條件下制備出的GWP凝膠在色澤上相較于WPC更適合作為脂肪替代品來代替黃油、動(dòng)植物油，也可作為增稠劑添加在部分色澤相近的食品中如蛋黃醬、肉品腸等，且可改善此類食品的感官品質(zhì)。
由圖3可知，乳清蛋白經(jīng)低聚木糖改性后其凝膠持水性顯著提高（P<0.05），且隨著低聚木糖添加量的增加持續(xù)升高，當(dāng)?shù)途勰咎翘砑?%時(shí)，GWP的凝膠持水性達(dá)到最高（82.15±0.41）%，較未改性乳清蛋白凝膠（62.15±1.10）%提高了（36.51±4.39）%，而當(dāng)繼續(xù)添加低聚木糖時(shí)，GWP凝膠持水性開始下降。
（5）質(zhì)構(gòu)特性分析 由表2可知，當(dāng)添加6%的低聚木糖時(shí)，GWP的凝膠硬度、彈性、內(nèi)聚性及咀嚼性均達(dá)到最大值，其中，不同添加量的低聚木糖對GWP的凝膠硬度影響顯著（P<0.05)，當(dāng)?shù)途勰咎翘砑?%時(shí)，GWP的凝膠硬度顯著大于其他樣品組（P<0.05)；彈性反映的是凝膠在外部應(yīng)力下發(fā)生形變后，恢復(fù)原狀的能力，GWP的凝膠彈性于6%時(shí)達(dá)到最大值，表明低聚木糖此添加量下，GWP形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密性達(dá)到最大程度，此時(shí)凝膠具有較好的彈性固體特征；咀嚼性是一個(gè)能客觀反映出食品口感的關(guān)鍵指標(biāo)，低聚木糖添加量為6%時(shí)咀嚼性顯著大于其他樣品組（P<0.05），表明此時(shí)GWP 凝膠口感最佳；各凝膠樣品的內(nèi)聚性無顯著區(qū)別（P>0.05），且當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿坷^續(xù)增加時(shí)，凝膠的硬度、彈性等指標(biāo)均下降。
由圖4可知，WPC所成凝膠呈海綿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是典型的堆積型凝膠，而GWP凝膠結(jié)構(gòu)中細(xì)凝膠束增加，這與預(yù)凝膠時(shí)體系中固形物總濃度以及蛋白質(zhì)分子的變性與聚集的相對速率有關(guān)，且GWP凝膠孔徑比WPC凝膠大，不同低聚木糖添加量下的GWP的凝膠結(jié)構(gòu)區(qū)別明顯，其中，接枝度相對較高的GWP(6% XOS)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中孔洞分布規(guī)則、均勻，且孔徑大小適中，有利于截留更多的水分子，使凝膠持水性提升，而當(dāng)?shù)途勰咎抢^續(xù)添加時(shí)，凝膠中的孔徑較大，凝膠致密程度開始下降，使得水分子易流失，由此可知，低聚木糖的引入能夠顯著改變?nèi)榍宓鞍椎木W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了乳清蛋白的凝膠特性。
由圖5（a）（b）可知，在25～90℃升溫階段，初始階段，各體系的儲(chǔ)能模量（G′）及損耗模量（G″）均很小，且G″>G′，說明此時(shí)體系流動(dòng)性較大，以粘性為主，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)分子因熱運(yùn)動(dòng)加快而開始交聯(lián)，各體系的G′與G″相繼驟增，且G′增加幅度遠(yuǎn)大于G″，表明體系發(fā)生相轉(zhuǎn)變，開始出現(xiàn)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，彈性固體特征逐漸明顯；90℃恒溫階段，各體系G′、G″繼續(xù)平穩(wěn)增加，此階段二硫鍵促進(jìn)蛋白分子進(jìn)一步交聯(lián)；而90℃到25℃的降溫期間，G′、G″進(jìn)一步增大，此階段主要是變性蛋白分子間的氫鍵發(fā)揮作用；最終，WPC的G′及G″分別達(dá)到297.03 Pa、53.21 Pa，GWP的G′及G″分別為：463.75 Pa、82.81 Pa（1%XOS）；676.70 Pa、121.99 Pa（3%XOS）；1287.65 Pa、228.21 Pa（6%XOS）、1059.74 Pa、176.86 Pa（9%XOS）；760.17 Pa、166.82 Pa（12%XOS），可見GWP的G′及G″較WPC明顯增加，這表明低聚木糖的加入顯著提高了乳清蛋白的粘彈性，且當(dāng)添加6%的低聚木糖時(shí)，GWP的G′及G″值最大，說明此時(shí)體系的粘彈性最高，其G′較未糖基化乳清蛋白提高了3.34倍，因此在低聚木糖添加量達(dá)到6%時(shí)，蛋白質(zhì)的糖基化修飾效果最佳，形成的凝膠結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，此時(shí)GWP具有最高的儲(chǔ)能模量；隨著低聚木糖添加量繼續(xù)增加，凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被削弱，導(dǎo)致凝膠G′降低，以上研究結(jié)果也驗(yàn)證了質(zhì)構(gòu)特性的準(zhǔn)確性。 由圖5（c）可知，溫度掃描開始時(shí)，各體系的tanδ值（損耗模量（G″）與儲(chǔ)能模量（G′）的比值）均大于1，在同一掃描溫度下，GWP的tanδ值隨著低聚木糖添加量的增加有增大趨勢；隨著掃描溫度繼續(xù)升高，tanδ值均逐漸降低至小于1。WPC凝膠溫度為77. 05℃，GWP的凝膠溫度分別為：59.37℃（1%XOS）、63.40℃（3%XOS）、78.07（6%XOS）、84.65℃（9%XOS）、84.13℃（12%XOS），由此可知，隨著低聚木糖添加量的增加，各GWP體系凝膠溫度逐漸升高，在低聚木糖添加量為6%時(shí)，GWP的凝膠溫度與WPC相近，均為78℃左右。
本研究通過分析不同添加量的低聚木糖與乳清蛋白在糖基化反應(yīng)過程中，GWP接枝度變化趨勢，確定糖基化反應(yīng)時(shí)間為2 h的GWP作為研究對象，此時(shí)經(jīng)6%低聚木糖修飾得到的GWP接枝度最大，通過分析各樣品紅外光譜圖的變化，則證明了低聚木糖糖鏈被共價(jià)引入蛋白體系，GWP制備成功，再進(jìn)一步分析不同低聚木糖添加量下的GWP的凝膠特性后,發(fā)現(xiàn)各GWP凝膠均具有良好的色澤,且持水性、質(zhì)構(gòu)特性、粘彈性均得到改善。當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿繛?%時(shí)，GWP凝膠具有最好的持水性、最高的粘彈性，且凝膠的彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性等衡量食品感官品質(zhì)的重要指標(biāo)都達(dá)到最佳。低聚木糖添加量大于6%后，GWP凝膠持水性、動(dòng)態(tài)黏彈性逐漸變差，其質(zhì)構(gòu)特性各項(xiàng)指標(biāo)也開始下降。因此，在糖基化時(shí)間為2h時(shí)，經(jīng)6%低聚木糖修飾的GWP的凝膠特性最好，可作為脂肪替代品或增稠劑應(yīng)用于烘培類及其他與之色澤相近的食品中，例如餅干、蛋黃醬、雞肉香腸等，為進(jìn)一步改善乳清蛋白的凝膠特性、開發(fā)乳清蛋白及低聚木糖在食品加工中的應(yīng)用潛力提供了理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。
參考資料： 李倩文,張莉杰,張川,李陽,陳樹興.低聚木糖對糖基化乳清蛋白凝膠特性的影響[J/OL].中國乳品工業(yè):1-10. |
