試驗設計 動物和試驗設計：實驗小鼠在22-24℃和40%-50%的相對濕度下飼養(yǎng)，12小時的光照/黑暗周期，自由獲取水和食物。 XOS對沙門氏菌引起的炎癥的影響：將80只6周齡的雄性C57BL/6J小鼠（21.6±1 g），隨機分為四組：對照組（Con）、5%XOS處理組（XOS）、腸道血清型沙門氏菌S. Typhimurium-感染的小鼠組（Con-ST）和使用5%XOS處理腸道血清型沙門氏菌S. Typhimurium-感染的小鼠組（XOS-ST）；每組有5個重復籠子，每個籠子有4只小鼠；XOS組和XOS-ST組的小鼠給予含有5%的XOS（w/w）水； Con組和Con-ST組的小鼠給予不含XOS的水。14天后，Con-ST組和XOS-ST組的小鼠用200 μL PBS灌胃1×106 CFU的沙門氏菌，而Con組和XOS組的小鼠只灌胃200 μL PBS；沙門氏菌感染后，每天記錄小鼠體重變化；感染沙門氏菌和未感染沙門氏菌的小鼠在第5天被執(zhí)行安樂死并收集樣本。 動物雙歧桿菌乳亞種BB12對沙門氏菌引起的炎癥的影響：45只雄性C57BL/6J小鼠（22.5±2 g）被隨機分配到Con組、Con-ST組和動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（BB12）處理感染S.Typhimurium的組（BB12-ST），每組有4個重復籠子，每個籠子有3-4只小鼠。Con和Con-ST組小鼠每天口服200 μL PBS，BB12-ST組小鼠在200 μL PBS中含2×108 CFU的BB12，處理持續(xù)14天。第15天，Con-ST和BB12-ST組用200 μL的PBS灌胃1×106 CFU的沙門氏菌，而Con組的小鼠只灌胃200μL PBS，沙門氏菌感染后的第5天收集樣本。 BB12對沙門氏菌的體外抑制研究：將107 CFU的BB12（0.1 mL）和106 CFU沙門氏菌（50 μL）接種在同一培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)24 h，用PBS對培養(yǎng)基進行連續(xù)稀釋，計算出平板上的CFU值，評估BB12對沙門氏菌的抑制作用；并檢測BB12上清液對沙門氏菌的抑制作用、丙酸鹽對沙門氏菌的體外抑制作用及BB12對沙門氏菌的抗粘附能力。 定量檢測小鼠組織樣本和培養(yǎng)基中的沙門氏菌菌落總數(shù)，并對小鼠結(jié)腸樣本顯微鏡下進行組織學分析、RNA的提取和定量、檢測小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平、測定小鼠盲腸內(nèi)容物和BB12上清液中的短鏈脂肪酸濃度（SCFAs）、小鼠結(jié)腸消化液的總基因組DNA檢測和特定細菌的定量。 試驗結(jié)果 （1）XOS對沙門氏菌感染的緩解作用 如圖1所示，根據(jù)圖1A的試驗設計，圖1B結(jié)果顯示5%的XOS補充劑明顯緩解了小鼠感染沙門氏菌后的體重下降（p<0.05）；此外圖1C-F顯示，與Con組相比，Con-ST組小鼠表現(xiàn)出較短的結(jié)腸長度（p<0.05）和較高的組織學評分（p<0.05），這些癥狀通過XOS治療后明顯逆轉(zhuǎn)（p<0.05）；圖1G和圖1H顯示，與Con組相比，Con-ST小鼠的臟器指數(shù)和肝、脾沙門氏菌計數(shù)均升高（p<0.05），但在XOS-ST小鼠中有所緩解（p<0.05），這表明XOS減少了小鼠感染沙門氏菌后向周圍器官的易位。
（2）XOS對沙門氏菌誘導的炎癥的抑制作用 如圖2A所示，所有組別中結(jié)腸IL-1β、IL-6、TNF-α和CXCL-2 mRNA的表達沒有差異（P>0.05），與Con-ST小鼠相比，XOS-ST小鼠降低了CXCL-1，增加了IFN-γ和IL10 mRNA表達水平（p<0.05）；圖2B顯示通過Elisa檢測，Con-ST小鼠結(jié)腸中IL-1β、TNF-α和IL-10的蛋白含量高于Con小鼠（p<0.05），而與Con-ST組小鼠相比，XOS-ST組小鼠結(jié)腸中的IL-1β、TNF-α和IL-10的蛋白水平顯著下降（p<0.05），且XOS組小鼠結(jié)腸中的IL-6、TNF-α和IL-10的蛋白水平比Con組低（p<0.05），這表明XOS減少了腸道炎癥；圖2C顯示Con-ST小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的濃度顯著高于Con小鼠（p<0.05），然而，與Con-ST小鼠相比，XOS-ST小鼠的這些蛋白水平顯著下降（p<0.05）。以上數(shù)據(jù)表明XOS可以緩解沙門氏菌感染后的促炎癥作用。 （3）XOS對腸道屏障的影響 如圖2D所示，粘液屏障蛋白，粘液蛋白-1和粘液蛋白-2以及結(jié)腸緊密連接蛋白-1（ZO-1）和閉合蛋白基因水平在所有組別中都沒有影響（p>0.05），然而，XOS組小鼠的結(jié)腸緊密連接蛋白-1（CLDN1）表達量高于Con組。圖2E結(jié)果顯示，XOS處理也不影響血清D-乳酸水平（p>0.05）。
（4）XOS對腸道微生物群的調(diào)節(jié)和對動物雙歧桿菌的促進作用 如圖3所示，分析了沙門氏菌感染后第5天結(jié)腸消化道樣本中微生物群落的差異，圖3A和圖3B顯示XOS和XOS-ST小鼠的Sobs和Shannon指數(shù)低于Con和Con-ST組，這表明補充含5%的XOS的水后，腸道微生物群的多樣性明顯下降；圖3C基于Bray-Curtis距離的PCoA圖表明，Con和Con-ST組的結(jié)腸微生物組成與其他組明顯分離（R=0.6929，p=0.001），而XOS和XOS-ST組之間的微生物組成結(jié)構沒有明顯分離。 如圖3D和3E顯示了門和屬水平的細菌組成的相對豐度。在門水平上，所有組的結(jié)腸消化道中都以擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門為主。在XOS和XOS-ST組中，XOS處理與放線菌門的相對豐度增加有關。在屬的層面上，Norank_f__Muribaculaceae屬在四個組的結(jié)腸消化道中占優(yōu)勢，重要的是，與雙歧桿菌相關的OUTs在XOS和XOS-ST小鼠中都被富集了。 如圖3F顯示在門水平上，與其他組相比，Con-ST組小鼠的擬桿菌和變形菌門的相對豐度顯著增加（p<0.05），而Con組小鼠的厚壁菌門比Con-ST和XOS-ST組高（p<0.05）；圖3G顯示在屬的層面上，所有組的乳酸菌的相對豐度沒有明顯的變化（p>0.05），然而，沙門氏菌和大腸桿菌-志賀氏菌的相對豐度在Con-ST小鼠中表現(xiàn)出明顯的屬水平升高（p<0.05），但對其他組沒有影響（p>0.05）；值得注意的是，圖3F和圖3G顯示與非XOS處理組相比，XOS處理組中放線菌門和雙歧桿菌屬的相對豐度顯著升高（p<0.05），而XOS和XOS-ST之間（p>0.05）或Con和Con-ST組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。 如圖3H顯示Con-ST組的細菌總復制數(shù)明顯低于XOS組（p<0.05），但在Con、XOS和XOS-ST組內(nèi)沒有影響（p>0.05）；此外，大腸桿菌的復制在Con-ST組中急劇增加（p<0.05），XOS-ST組的乳酸菌復制數(shù)比Con和XOS組低（p<0.05），Con、XOS和Con-ST組內(nèi)無差異（p>0.05）。圖3I顯示，攝入XOS顯著地促進了結(jié)腸消化道中動物雙歧桿菌的豐度。
（5）動物雙歧桿菌乳亞種BB12減輕沙門氏菌的感染 如圖4所示，接種了BB12的小鼠在沙門氏菌灌胃后體重下降被抑制（p<0.05）,與Con組相比，Con-ST組小鼠的結(jié)腸長度更短，組織學評分、相對器官重量以及肝臟和脾臟中的沙門氏菌數(shù)量更高（p<0.05），但這些癥狀在BB12治療的小鼠中也得到了逆轉(zhuǎn)，說明BB12抑制了沙門氏菌的感染和易位（p<0.05）。
（6）動物雙歧桿菌乳亞種BB12對沙門氏菌誘導的炎癥和腸道屏障的影響 如圖5A所示，Con-ST組小鼠結(jié)腸中IL-1β、TNF-α和CXCL-2的相對mRNA表達高于Con和BB12-ST組（p<0.05），而Con和BB12-ST組之間沒有差異（p>0.05）；三組之間結(jié)腸組織中IFN-γ、IL-6和IL-10的相對mRNA表達沒有差異（p>0.05），然而，與Con組小鼠相比，Con-ST組的CXCL-1有增加的趨勢（p<0.1）。同樣，圖5B顯示，沙門氏菌感染后的小鼠結(jié)腸中IL-1 β、IL-6和TNF-α水平的顯著增加也被BB12所緩解（p<0.05），而IL-10未能明顯改變，此外，圖5C顯示與Con-ST小鼠相比，BB12-ST小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平有所下降（p<0.05）。 如圖5D顯示，在Con-ST組和BB12-ST組之間沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中緊密連接分子和粘液蛋白的相對表達差異（p>0.05）；然而，圖5E顯示BB12-ST組降低了血清中D-乳酸的濃度（p<0.05），這表明BB12可能改善上皮屏障。以上數(shù)據(jù)表明，BB12可以改善沙門氏菌誘發(fā)的炎癥，并對結(jié)腸的機械和粘膜屏障產(chǎn)生輕微影響。
（7）動物雙歧桿菌乳亞種BB12通過維持盲腸中的丙酸鹽來抵抗沙門氏菌的定植 如圖6A和6B所示，在BB12灌胃14天后，動物雙歧桿菌和BB12在糞便中的含量明顯上升（P<0.05）；圖6C和6D顯示在沙門氏菌感染后的第5天，BB12-ST組盲腸內(nèi)容物中的動物雙歧桿菌和BB12水平明顯高于Con組和Con-ST組；此外，圖6E對盲腸內(nèi)容物中總菌數(shù)、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的復制數(shù)測定表明，與Con和Con-ST組相比，BB12-ST組小鼠的雙歧桿菌數(shù)量顯著增加（p<0.05），但BB12-ST組小鼠的沙門氏菌復制數(shù)顯著低于Con-ST組（P<0.05）；在三組內(nèi)，總細菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的復制數(shù)沒有改變（p>0.05）。 如圖6F-6J顯示，所有組別都沒有觀察到對盲腸中乳酸、乙酸和丁酸水平的影響（p>0.05），但與Con-ST組小鼠相比，Con組和BB12-ST組的丙酸鹽和總酸的濃度都有明顯的增加（p<0.05）；圖6K體外試驗結(jié)果顯示，當與盲腸內(nèi)容物相同水平的LB培養(yǎng)基中丙酸濃度達到800 mg/L時，沙門氏菌的生長受到了極大的抑制(p<0.05)；以上結(jié)果表明，BB12通過維持腸道SCFAs的水平來減少沙門氏菌的數(shù)量。
（8）動物雙歧桿菌乳亞種BB12對沙門氏菌體外生長和粘附的抑制作用 如圖7A所示，BB12和沙門氏菌的共同培養(yǎng)顯示，沙門氏菌的生長受到BB12的極度抑制（p<0.05），圖7B顯示BB12的上清液也抑制了沙門氏菌的生長，且BB12的上清液比LB-MRS組有更明顯的抑制作用，這表明BB12的代謝物可以影響其抑制作用。與體內(nèi)不一致的是，乳酸和乙酸是上清液中的主要SCFAs，而在上清液中沒有檢測到丙酸鹽，此外，圖7C顯示BB12顯著降低了沙門氏菌在Caco-2細胞模型中的粘附能力（p<0.05）。
試驗結(jié)論 本研究探討了益生元XOS對小鼠感染沙門氏菌后的保護作用及其機制，結(jié)果表明XOS可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和減少病原體的數(shù)量來減輕沙門氏菌引起的炎癥；XOS刺激動物雙歧桿菌的豐度增加，動物雙歧桿菌通過維持腸道SCFAs水平和抑制粘附能力來抵御沙門氏菌的定植，因此XOS可被視為一種功能性食品，通過刺激雙歧桿菌從而通過維持腸道SCFAs水平和抑制粘附性來抵抗沙門氏菌的定植。
參考資料： Pang J, Wang S, Wang Z, et al. Xylo‐oligosaccharide alleviates Salmonella induced inflammation by stimulating Bifidobacterium animalis and inhibiting Salmonella colonization[J]. The FASEB Journal, 2021, 35(11). |
