試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)：喂食小鼠添加XOS或標(biāo)準(zhǔn)玉米淀粉作為對(duì)照的改良天然1430 Altromin飲食，其量等于碳水化合物部分的10%。 組織學(xué)分析:以盲法對(duì)13周齡小鼠的每個(gè)胰腺中至少50個(gè)胰島和每個(gè)唾液腺的8個(gè)連續(xù)切片進(jìn)行胰島炎和涎腺炎評(píng)分。 腸道微生物群組成分析：取自4周齡未經(jīng)處理和經(jīng)抗生素處理的給予對(duì)照或XOS補(bǔ)充飲食的雌性NOD小鼠的糞便，以及7周齡接受來(lái)自對(duì)照和XOS喂養(yǎng)NOD小鼠的糞便微生物群移植的NOD小鼠，進(jìn)行DNA提取、基于標(biāo)簽編碼的16S rRNA基因擴(kuò)增子MiSeq測(cè)序和測(cè)序分析，以及來(lái)自糞便和腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌DNA實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）。 飲食對(duì)代謝和葡萄糖耐量的影響：對(duì)于OGTT（口服葡萄糖耐量試驗(yàn)），8周齡的小鼠在口服75 mg/小鼠的葡萄糖之前禁食6 h；測(cè)量在葡萄糖挑戰(zhàn)后的0、15、30、60、90和120 min小鼠血糖，以及對(duì)小鼠的血清進(jìn)行循環(huán)胰島素和瘦素水平分析。 SCFA分析：從13周齡的小鼠身上取下結(jié)腸內(nèi)容物，通過(guò)氣相色譜法測(cè)量SCFA濃度。 胰高血糖素樣肽-1分析：收集13周齡小鼠的血清樣本，使用發(fā)光氧導(dǎo)免疫測(cè)定法（LOCI）分析胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的總水平。 腸道通透性：在7周齡的小鼠禁食禁水4 h后，口服600 mg/kg FITC-葡聚糖，進(jìn)行體內(nèi)腸道滲透性檢測(cè)；測(cè)量收集自13周齡小鼠血清中的人連蛋白（Zonulin）濃度。 定量PCR的基因表達(dá)：13周齡的小鼠被殺死后，對(duì)結(jié)腸和回腸片段進(jìn)行RNA分離和cDNA合成。Muc1、Muc2、Ocln和Tjp1用于評(píng)估腸道屏障，Arg1、Tgfβ（也稱為Tgfb1）；Gzmb、Fasl和Cd8a TaqMan基因表達(dá)檢測(cè)用于巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)基因用于qPCR分析。 流式細(xì)胞儀分析XOS飲食的潛在抗炎作用：小鼠在13周齡時(shí)被殺死，用抗體混合物對(duì)CD3-FITC、NK/NKT-PE、CD8-APC、CD11c-FITC、F4.80-PerCP-CY5.5、CD4-PerCP-CY5.5、forkhead box P3 (FOXP3)-PE和CD69-APC在腸系膜、胰腺淋巴結(jié)和脾臟單細(xì)胞懸液中進(jìn)行染色。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）飲食中的XOS調(diào)節(jié)NOD小鼠的自身免疫表現(xiàn) 如圖1a所示，攝入XOS補(bǔ)充飲食25周后，糖尿病發(fā)病率明顯降低（分別為26%和50%），30周齡時(shí)發(fā)病率不再有差異；但與對(duì)照飲食相比，XOS喂養(yǎng)小鼠的糖尿病發(fā)病時(shí)間明顯推遲（圖1c）；圖1b顯示將XOS和對(duì)照組喂養(yǎng)的小鼠的糞便微生物群移植到安置在無(wú)菌隔離器中經(jīng)抗生素處理的NOD小鼠的幼崽身上，并不足以轉(zhuǎn)移糖尿病發(fā)病的延遲；對(duì)胰腺和唾液腺進(jìn)行組織學(xué)分析結(jié)果顯示，低聚木糖（XOS）對(duì)唾液腺病灶大小和數(shù)目的影響非常明顯，而對(duì)胰腺的影響則較為溫和（圖1d和1e）。
（2）飲食對(duì)經(jīng)抗生素處理的小鼠的胰島和唾液腺炎的影響 如圖1e和圖1f所示，經(jīng)抗生素處理的對(duì)照飲食小鼠完全發(fā)展為胰腺炎，其程度與未經(jīng)處理的小鼠相同；在斷奶前只喂食補(bǔ)充XOS飲食的小鼠中，胰腺炎輕微下降，而在同時(shí)給予抗生素的小鼠中胰腺炎減少的更多；雄性NOD小鼠發(fā)生的胰腺炎比使用抗生素的雌性小鼠要少，但在喂食XOS的補(bǔ)充飲食時(shí)更少（圖1g-1h）。 如圖1d所示，當(dāng)評(píng)估同一組小鼠的唾液腺炎程度時(shí)，發(fā)現(xiàn)生命早期的XOS飲食足以降低生命后期的唾液腺炎評(píng)分；用抗生素處理的對(duì)照組和XOS喂養(yǎng)的小鼠都出現(xiàn)了與未處理的XOS喂養(yǎng)小鼠相同的低程度唾液腺炎。 如圖2a和2b所示，PCoA在4周齡時(shí)由于飲食的原因顯示出明顯的集群（基于未加權(quán)和加權(quán)UniFrac距離矩陣的PERMANOVA：分別為p<0.05，R2=0.15和p<0.05，R2=0.18），這種分離主要是由副桿菌屬以及四個(gè)豐度較低（<2%）的屬驅(qū)動(dòng)的，與對(duì)照組小鼠（1%）相比，XOS喂養(yǎng)小鼠的豐度相對(duì)較高（12%）（圖2e）。
（3）抗生素減少腸道微生物群 如圖2j所示，通過(guò)16S rRNA基因（V3區(qū)域）qPCR發(fā)現(xiàn)抗生素可使16S的總拷貝數(shù)減少4000倍以上；擴(kuò)增子測(cè)序表明飲食組中剩余的少數(shù)細(xì)菌主要由鏈球菌屬組成，達(dá)到擴(kuò)增子豐度的98%（±1%）（圖2f）；此外，與對(duì)照組（0%）抗生素處理的小鼠相比，只有一個(gè)豐度很低的屬即黃桿菌屬，在XOS喂食的小鼠（占剩余微生物組的0.1%）顯著升高（圖2g）；這種低豐度分類群的單一差異是導(dǎo)致兩個(gè)飲食組在未加權(quán)PCoA圖中單獨(dú)聚類的主要原因：P<0.05, R2= 0.086（圖2c）；因此在加權(quán)PCoA圖中無(wú)法觀察到差異：P=0.17，R2= 0.17（圖2d），綜合來(lái)看，數(shù)據(jù)表明XOS對(duì)胰腺炎有直接的微生物群獨(dú)立性影響。 （4）益生元對(duì)腸道屏障功能和粘膜炎癥的改善 如圖3a所示，與喂養(yǎng)對(duì)照組飲食的小鼠相比，喂養(yǎng)XOS小鼠的屏障滲透性確實(shí)較低；圖3c顯示腸系膜淋巴結(jié)中16S rRNA基因的qPCR也證實(shí)了這一點(diǎn)，顯示與對(duì)照組小鼠相比，喂食XOS的小鼠中能夠穿過(guò)腸道屏障并到達(dá)引流淋巴結(jié)的微生物較少；如圖3e、3h所示，與黏液相關(guān)的基因在低聚木糖（XOS）組小鼠回腸（Muc2）和結(jié)腸（Muc1）中也表達(dá)上調(diào)；圖3i-l顯示，其他屏障相關(guān)基因，如Ocln和Tjp1（分別編碼閉鎖素和緊密連接蛋白1）在早期喂食低聚木糖（XOS）的小鼠回腸和結(jié)腸中均顯著上調(diào)。圖3i-j結(jié)果表明在生命早期補(bǔ)充XOS似乎以獨(dú)立于微生物的方式調(diào)節(jié)這些部分的屏障功能，因?yàn)檫@種差異在抗生素處理的小鼠中持續(xù)存在。 如圖3b所示，代表回腸屏障功能的FITC-葡聚糖試驗(yàn)以及圖3k、3l回腸組織中的基因表達(dá)都沒(méi)有顯示出抗生素處理小鼠的屏障得到改善；圖3d表明兩個(gè)飲食組的血清中該蛋白的水平是相似的。
（5）微生物群介導(dǎo)的粘膜炎癥的飲食變化 如圖4a、4b所示，與對(duì)照組小鼠相比，XOS喂養(yǎng)的小鼠在胰腺和腸系膜淋巴結(jié)以及脾臟中的CD8+NKT細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的水平較低；圖4c-e中，Cd8a、Gzmb和Fasl qPCR也能證實(shí)，顯示這些基因的表達(dá)在XOS喂養(yǎng)的小鼠中被類似地下調(diào)，但在斷奶時(shí)轉(zhuǎn)為對(duì)照飲食的小鼠中卻沒(méi)有。 如圖4f所示，與對(duì)照組小鼠相比，XOS喂養(yǎng)的小鼠局部淋巴結(jié)中活化（CD69+）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例略高；圖4j顯示在生命早期喂食XOS飲食的小鼠中，Tgfβ基因的表達(dá)水平更高，這進(jìn)一步表明局部環(huán)境更加抗炎；此外，圖4g顯示F4.80+巨噬細(xì)胞在局部和全身都被XOS飲食所誘導(dǎo)。然而，圖4 h表明刺激炎癥的典型CD11c+M1巨噬細(xì)胞的比例，在XOS喂養(yǎng)的小鼠脾臟中減少了；巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加可能是由于抗炎的M2巨噬細(xì)胞的增加，它們也是TGF-β的主要生產(chǎn)者；圖4i顯示 M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arg1（編碼精氨酸酶1）的基因表達(dá)也表明了這一點(diǎn)，該標(biāo)志物在XOS喂養(yǎng)的小鼠中表達(dá)水平更高。
如圖5a所示，通過(guò)將XOS和對(duì)照組喂養(yǎng)的NOD小鼠的脾細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠身上，結(jié)果在兩組中移植都誘發(fā)了糖尿病，且XOS組的影響更大；圖5b顯示將移植的XOS和對(duì)照組喂養(yǎng)NOD小鼠中的脾細(xì)胞在生命早期用抗生素處理，結(jié)果兩組之間的糖尿病發(fā)病率是相似的，這與圖5e、5f中抗生素處理的小鼠中CD8+免疫細(xì)胞缺乏差異很對(duì)應(yīng)。
試驗(yàn)結(jié)論 本文研究了益生元低聚木糖（XOS）對(duì)NOD小鼠胰島和唾液腺炎癥的影響，并測(cè)試了這些是否由腸道微生物群介導(dǎo)，結(jié)果雌性NOD小鼠及其后代在糖尿病發(fā)病前或斷奶前，喂食含有低聚木糖（XOS）的飲食組小鼠的1型糖尿病的發(fā)病顯著推遲，且胰島及唾液腺中的細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少；菌群移植無(wú)法轉(zhuǎn)移低聚木糖（XOS）飲食延緩1型糖尿病發(fā)病的保護(hù)作用。小鼠經(jīng)抗生素處理后，喂食低聚木糖（XOS）組小鼠及對(duì)照組小鼠的唾液腺炎癥無(wú)顯著差異，但低聚木糖（XOS）組小鼠的胰島炎癥顯著減少。低聚木糖（XOS）飲食顯著降低了小鼠腸道通透性，并促進(jìn)M1到M2巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，增加活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的豐度。以上結(jié)果表明，益生元 XOS對(duì)唾液腺炎癥具有微生物群依賴性的影響，對(duì)胰島病理學(xué)具有微生物群獨(dú)立性的影響，這些影響伴隨著腸道屏障的改善。
參考資料： Hansen C H F, Larsen C S, Petersson H O , et al. Targeting gut microbiota and barrier function with prebiotics to alleviate autoimmune manifestations in NOD mice[J]. Diabetologia, 2019, 62(4).
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