試驗(yàn)設(shè)計(jì) 原料：臨沂產(chǎn)魯黑豆2號(hào)品種的大粒黑豆；濟(jì)寧產(chǎn)神農(nóng)架品種的大粒黑豆；黑龍江產(chǎn)哈爾濱小黑豆品種的小粒黑豆；低聚木糖。 實(shí)驗(yàn)方法： 大豆抗毒素誘導(dǎo)與合成確認(rèn)： ①XOS誘導(dǎo)：將無霉斑、粒徑一致且顆粒飽滿的黑豆用75%乙醇處理3 min，滅菌蒸餾水清洗若干次，置于25℃左右的滅菌水中浸泡5 h；然后用無菌刀片將膨脹的種子分為2片子葉，在子葉表面劃出約9～12 mm2的傷口，且背面不發(fā)生破裂；將子葉置于培養(yǎng)皿內(nèi)潤濕的無菌濾紙上，向傷口內(nèi)加入60 μL無菌過濾XOS溶液并用封口膜密封，在相對(duì)濕度（RH）65%、24～26℃條件下暗培養(yǎng)若干天。對(duì)照黑豆子葉處理方法如上，傷口加入60 μL滅菌水。樣品提取步驟如下：子葉經(jīng)凍干研磨后 ，稱取0.3 g粉末于離心管中，以料液比（g·mL-1）為1∶6的比例加入1.8 mL 80%乙醇，蓋嚴(yán)并浸在50℃水浴中 ，磁力攪拌提取1 h，以15000 r·min-1離心15 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，即得粗提液。 ②大豆抗毒素合成確認(rèn)：粗提液經(jīng)半制備HPLC儀-收集器分離餾分、高效液相色譜（HPLC）分析及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）確認(rèn)；半制備HPLC方法采用Waters 600E（配備Waters PAD檢測(cè)器）；YMC-Pack ODS-AQ C18（20 mm×250 mm，5 μm）制備色譜柱；流動(dòng)相A、B為90%乙腈水與5%乙腈水，流速3.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積2 mL，波長285 nm，檢測(cè)時(shí)間90 min；梯度洗脫：0～10 min，100%B；10～70 min，100%B→0%B；70～90 min，0%B；大豆抗毒素含量測(cè)定采用Waters 2695 HPLC-2996 PDA檢測(cè)器及色譜工作站；SunChrom反相C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40℃；流動(dòng)相A、B為pH 3.0乙酸水與乙腈，流速1.0 mL·min-1，洗脫方法如表1所示；進(jìn)樣體積10 μL，波長285 nm，檢測(cè)時(shí)間65 min，含量計(jì)算依據(jù)課題組建立的大豆抗毒素積分值（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）的回歸方程：Y=1.0×107X+754.32，R2=0.9999。
3個(gè)產(chǎn)地黑豆中大豆抗毒素誘導(dǎo)合成量的比較：不同產(chǎn)地黑豆在XOS誘導(dǎo)含量4.0%，誘導(dǎo)時(shí)間3 d，培養(yǎng)溫度25℃時(shí)，比較大豆抗毒素的合成累積量。 單因素試驗(yàn)：分別研究誘導(dǎo)時(shí)間、XOS質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度對(duì)大豆抗毒素合成量的影響，其中，誘導(dǎo)時(shí)間單因素試驗(yàn)：XOS質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL?1，培養(yǎng)溫度25℃，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6和7 d；XOS質(zhì)量濃度單因素試驗(yàn)：誘導(dǎo)時(shí)間分別為4 d，培養(yǎng)溫度25℃，設(shè)置XOS質(zhì)量濃度2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0 g·100 mL?1；培養(yǎng)溫度單因素試驗(yàn)：誘導(dǎo)時(shí)間4 d，XOS質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL?1，設(shè)置培養(yǎng)溫度分別為17、21、25、29和33℃，進(jìn)行XOS誘導(dǎo)大豆抗毒素合成條件的優(yōu)化。 響應(yīng)面試驗(yàn)：利用CCD-RSM對(duì)大豆抗毒素合成條件進(jìn)行綜合優(yōu)化，將自變量誘導(dǎo)時(shí)間（X1）、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度（X2）及培養(yǎng)溫度（X3）編碼為五水平，即-1.682、-1、0、+1、+1.682，各因素水平為誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d、XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度3.0～7.0 g·100 mL?1、培養(yǎng)溫度17～33℃（表2）；試驗(yàn)設(shè)計(jì)含20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（14個(gè)析因點(diǎn)和6個(gè)零點(diǎn)）（表3），在響應(yīng)面試驗(yàn)中，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素五水平的CCD-RSM試驗(yàn)，獲得XOS誘導(dǎo)黑豆子葉中大豆抗毒素累積量的優(yōu)化條件及其下的預(yù)測(cè)值，此外，對(duì)模型的顯著性與適用性進(jìn)行方差分析。
優(yōu)化條件驗(yàn)證：對(duì)獲得最高誘導(dǎo)量的大豆抗毒素優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果與軟件獲得的預(yù)測(cè)值是否一致。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）大豆抗毒素合成確認(rèn) 由圖1A可知，在XOS誘導(dǎo)子葉組織而獲得提取物的HPLC譜圖中，新產(chǎn)生化合物的色譜峰保留時(shí)間約在22.5 min，相較與對(duì)照譜圖（圖1B）沒有出現(xiàn)；通過半制備HPLC儀分離獲得受刺激子葉組織中合成的新化合物，HPLC分析確認(rèn)及純化濃縮餾分中的化合物，且利用HPLC與UPLC-MS/MS對(duì)濃縮液進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，分離純化得到的新化合物的HPLC譜圖如圖1C所示；采用電噴霧離子源正離子（ESI+）模式下的UPLC-MS/MS對(duì)新化合物分析，由于3種最常見GLY異構(gòu)體Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ的分子式與分子量分別為C20H18O5與338，得出質(zhì)譜圖中質(zhì)荷比（m/z）339是大豆抗毒素質(zhì)子化得到的準(zhǔn)分子離子[M+H]+，同時(shí)m/z 321為[M+H]+丟失1個(gè)水分子產(chǎn)生的碎片離子[M+H-H2O]+，m/z 229為[M+H-H2O]+丟失1個(gè)苯氧基團(tuán)產(chǎn)生的碎片離子[M+H-H2O-C6H4O]+（圖1D），由獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到，在受到外源刺激的子葉組織提取物的色譜圖中，保留時(shí)間約22.5 min的新合成化合物確認(rèn)為GLY Ⅰ、GLY Ⅱ與GLY Ⅲ，由上可知，XOS對(duì)黑豆子葉組織的外源誘導(dǎo)刺激作用能夠?qū)е伦尤~組織合成和積累次生代謝產(chǎn)物GLYs，同時(shí) GLYs的誘導(dǎo)合成也是子葉組織細(xì)胞對(duì)XOS刺激作出的防御性反應(yīng)中的一部分。
（2）不同產(chǎn)地黑豆子葉中GLYs含量的分析 由圖2可知，在XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1與誘導(dǎo)時(shí)間3 d條件下，臨沂產(chǎn)大粒黑豆、濟(jì)寧產(chǎn)大粒黑豆與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆中GLYs累積量分別為1.4252、0.9732、0.8990 mg·g-1 DW，其中，濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆子葉中GLYs累積量顯著低于臨沂產(chǎn)大粒黑豆，而濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆間無顯著差異，由上可得，臨沂產(chǎn)大粒黑豆更適用于后續(xù)GLYs誘導(dǎo)合成條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)。
（3）GLYs合成條件的優(yōu)化 由圖3可知，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2 d時(shí)，GLYs累積量達(dá)到較高水平，此后隨著時(shí)間的延長累積量增加不明顯；當(dāng)XOS質(zhì)量濃度為4.0 g·100 mL?1，培養(yǎng)溫度為25℃，在誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d下的GLYs累積量差異不顯著（P>0.05），故誘導(dǎo)時(shí)間選擇2～6 d；當(dāng)XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度在2.0～8.0 g·100 mL?1時(shí)，GLYs累積量發(fā)生明顯變化，而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間與培養(yǎng)溫度一定時(shí)，誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為4.0 g·100 mL-1時(shí)合成GLYs量顯著高于8.0%時(shí)的累積量（P<0.05），與7.0%時(shí)的累積量差異不顯著（P>0.05），考慮到GLYs積累量及XOS誘導(dǎo)質(zhì)量用量，故誘導(dǎo)質(zhì)量濃度選擇在2.0~6.0 g·100 mL?1；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)質(zhì)量濃度一定時(shí)，培養(yǎng)溫度25℃下的GLYs累積量顯著高于其他培養(yǎng)溫度（P<0.05），17～33℃范圍的GLYs含量發(fā)生明顯變化，故選擇此培養(yǎng)溫度范圍，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)時(shí)間2～6 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度2.0～6.0 g·100 mL?1及培養(yǎng)溫度17～33℃為中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行的單因素水平范圍。
（4）中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)的分析 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用三因素五水平的CCD-RSM試驗(yàn)優(yōu)化GLYs合成的誘導(dǎo)條件，表3為CCD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)及GLYs含量結(jié)果，應(yīng)用 Design-Expert 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多項(xiàng)回歸方程如下。 Y=-10.53155+1.16627X1+0.90409X2+0.65017X3+9.65×103X1X2+4.5625×104X1X3+0.01281X2X3-0.1509X12-0.15823X22-0.01478X3 2 （1） 式中，Y為GLYs累積量（mg·g-1 DW），X1為誘導(dǎo)時(shí)間（d），X2為誘導(dǎo)質(zhì)量濃度（g·100 mL?1），X3為培養(yǎng)溫度（℃），回歸系數(shù)R2=0.9254，表明模型擬合較好。 GLYs合成的優(yōu)化條件為誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.08 g·100 mL-1、培養(yǎng)溫度23.83℃，此時(shí)GLYs累積量為1.4118 mg·g-1 DW；對(duì)建立的模型進(jìn)行方差分析（表4），F(xiàn)值為13.78（P=0.0002），表明模型適合度達(dá)到顯著水平；響應(yīng)面試驗(yàn)的誤差較小（失擬項(xiàng)F=0.67，P=0.6650）；培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs合成累積量影響極顯著，誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度對(duì)GLYs合成累積量影響不顯著；各因素間交互作用不顯著；各因素對(duì)GLYs累積量的影響呈現(xiàn)二次曲線關(guān)系（P<0.001）；且培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs合成累積量的影響較大，其次為誘導(dǎo)質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，綜上所述，此模型可用于預(yù)測(cè)GLYs的合成累積量。
本研究預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（Pred R2）和調(diào)整相關(guān)系數(shù)（Adj R2）分別為0.7069與0.8583，二者接近，顯示GLYs的擬合過程有效；變異系數(shù)（CV）為11.02%，顯示建立的模型具有較高的精確度與可信度；模型的信噪比為11.427（>4）,顯示建立的模型有較高的精密度，由此表明，回歸模型有良好的預(yù)測(cè)性；Design-Expert軟件分析（圖4）表明，殘差的正態(tài)概率分布和預(yù)測(cè)值與實(shí)際值分布均處于一條直線，殘差與預(yù)測(cè)值分布較為分散，顯示擬合模型具有較好的適應(yīng)性。
由圖5可知，當(dāng)以培養(yǎng)溫度為中心點(diǎn)時(shí)，GLYs累積量隨著誘導(dǎo)時(shí)間從2～4 d先增加后降低；誘導(dǎo)質(zhì)量濃度在2.0～4.0 g·100 mL?1時(shí)明顯增加，之后隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸減少；曲線走勢(shì)顯示誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的3D曲面上升幅度比誘導(dǎo)時(shí)間的曲面上升稍明顯（圖5A），表明在研究誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)質(zhì)量濃度交互效應(yīng)時(shí)，誘導(dǎo)質(zhì)量濃度對(duì)GLYs累積量影響更為明顯；誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的等高線變化比誘導(dǎo)時(shí)間明顯（圖5B）；當(dāng)以誘導(dǎo)時(shí)間為中心點(diǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面3D曲面的升高幅度比誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的曲面上升幅度大（圖5C）；培養(yǎng)溫度的等高線變化比誘導(dǎo)質(zhì)量濃度明顯（圖5D）；當(dāng)以誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為中心點(diǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面3D曲面的升高幅度比誘導(dǎo)質(zhì)量時(shí)間的曲面上升幅度大（圖5E）；培養(yǎng)溫度的等高線變化比誘導(dǎo)時(shí)間明顯（圖5F），綜上，培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs累積量影響顯著。
（5）驗(yàn)證試驗(yàn) 在XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL?1與誘導(dǎo)時(shí)間3 d條件下，臨沂產(chǎn)大粒黑豆誘導(dǎo)獲得的GLYs累積量顯著高于濟(jì)寧產(chǎn)大粒與黑龍江產(chǎn)小粒黑豆（P<0.05），為了驗(yàn)證大豆抗毒素預(yù)測(cè)值的優(yōu)化條件，在獲得的優(yōu)化條件（誘導(dǎo)時(shí)間4.03 d、誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.08 g·100 mL?1、培養(yǎng)溫度23.83℃）下，選擇臨沂大粒黑豆材料開展驗(yàn)證工作；為滿足驗(yàn)證試驗(yàn)的可操作性，驗(yàn)證條件設(shè)為誘導(dǎo)時(shí)間4 d、低聚木糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4 g·100 mL?1、培養(yǎng)溫度24℃。在3次重復(fù)試驗(yàn)中，GLYs誘導(dǎo)合成量達(dá)到1.3765 mg·g-1 DW，與理論預(yù)測(cè)值1.4118 mg·g-1 DW的相對(duì)誤差為2.5%，表明響應(yīng)面模型與實(shí)際合成量擬合良好，中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)獲得的模型有較好的預(yù)測(cè)性。 試驗(yàn)結(jié)論 為研究大豆抗毒素（GLYs）合成的誘導(dǎo)條件，以低聚木糖（XOS）誘導(dǎo)黑豆合成的GLYs含量為考察目標(biāo)，以XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度為考察單因素，在此基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化GLYs合成量的誘導(dǎo)條件，結(jié)果顯示，建立的模型適合度顯著（F=13.780），GLYs實(shí)際合成量與預(yù)測(cè)值擬合良好（R2=0.9254），優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)條件為XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度4.0 g·100 mL-1，培養(yǎng)溫度24℃，誘導(dǎo)時(shí)間4 d，在此條件下，GLYs合成量為1.3765 mg·g-1 DW，與預(yù)測(cè)值（1.4118 mg·g-1 DW）相比，相對(duì)誤差較小，培養(yǎng)溫度對(duì)GLYs合成量影響極顯著（P<0.05）；XOS誘導(dǎo)質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GLYs合成量影響不顯著；三因素交互作用對(duì)GLYs合成量影響均不顯著，由此表明，該方法合理可行，為大豆抗毒素制備及功能產(chǎn)品開發(fā)提供了理論依據(jù)。
參考資料： 王凱強(qiáng),楊雪,李常風(fēng)等.響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖誘導(dǎo)大豆抗毒素合成條件[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2022,24(10):208-217. |
