試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將5周齡、體重18-20 g、無特定病原體的雄性C57BL/6J小鼠在室溫（22±1℃）、濕度（55%±10%）的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h。將小鼠分為五組，喂食標(biāo)準(zhǔn)生長飼料和無菌水，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見圖1；適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為不同的實(shí)驗(yàn)組，除對(duì)照組外，所有小鼠均接受慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（CUMS）方案，建立小鼠抑郁癥模型，其余四組小鼠在研究過程中被給予不同劑量的XOS（0.23、0.50和1.0 g kg-1 day-1，溶于無菌水中），而后對(duì)小鼠進(jìn)行行為測試，在所有測試之前，小鼠需在測試室中適應(yīng)至少30分鐘，在對(duì)下一只小鼠進(jìn)行行為實(shí)驗(yàn)之前，需用70%的乙醇清洗測試設(shè)備，避免氣味刺激。
蔗糖偏好試驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠提前在1%的蔗糖溶液（w/v）中適應(yīng)48小時(shí)，剝奪食物和水24小時(shí)后進(jìn)行12小時(shí)的蔗糖偏好試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中途調(diào)換兩個(gè)瓶子的位置，記錄試驗(yàn)前后瓶子的重量差，計(jì)算蔗糖偏好指數(shù)。 曠場試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)裝置包括一個(gè)白色的開放箱（40×40×35厘米），實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將每只小鼠放置在相同的位置，使用視頻跟蹤系統(tǒng)（EthoVision, Noldus Inc., Leesburg, VA, USA）記錄并分析10分鐘內(nèi)小鼠在中心區(qū)域花費(fèi)的總時(shí)間。 高架十字迷宮試驗(yàn)：高架十字迷宮裝置包含一個(gè)6×6厘米的中心廣場，垂直放置，有兩個(gè)封閉的和兩個(gè)開放的手臂，每個(gè)長度為35厘米，距離地面60厘米，允許所有小鼠自由移動(dòng)6分鐘，并通過視頻跟蹤系統(tǒng)記錄它們的運(yùn)動(dòng)，對(duì)進(jìn)入的次數(shù)和在開放臂中花費(fèi)的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：使用一個(gè)30厘米的玻璃缸，水溫23-25℃，第一天，強(qiáng)迫所有小鼠游泳15分鐘，以進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練；第二天，將小鼠放置在相同的環(huán)境中6分鐘，如果它們只表現(xiàn)出一點(diǎn)點(diǎn)的努力來保持其頭部在水面以上，則被認(rèn)為是處于絕望狀態(tài)，記錄最后4分鐘的絕望狀態(tài)。 懸尾試驗(yàn)：用膠布將小鼠的尾巴尖端（距尖端1厘米）固定在懸吊桿上（離地面30厘米），用視頻跟蹤系統(tǒng)監(jiān)測運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，持續(xù)6分鐘，記錄靜止時(shí)間。 SCFAs濃度分析：將已知質(zhì)量的糞便直接稱量到無菌試管中，在500 μL飽和氯化鈉溶液中浸泡30分鐘，均質(zhì)，然后用40 μL10%硫酸酸化，在酸化的勻漿中，加入1 mL乙醚，在4℃下以18000 g離心15分鐘，將上清液從0.22 μm的有機(jī)相濾膜上移走，并小心地轉(zhuǎn)移到氣相小瓶中進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。 神經(jīng)遞質(zhì)、色氨酸和色氨酸代謝物的測定：測定前額皮質(zhì)（PFC）中血清素（5-HT）、5-羥色胺（5-HTP）和γ-氨基丁酸（GABA）的濃度及結(jié)腸中的色氨酸和色氨酸代謝產(chǎn)物、血清中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平。 糞便微生物群的16S rRNA擴(kuò)增子測序：小鼠處死前將其糞便收集到無菌離心管中，進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增子測序，測定其腸道菌群的變化。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）XOS對(duì)CUMS模型小鼠生長狀況的影響 如圖1b所示，在CUMS過程中，CUMS模型組的體重變化持續(xù)低于對(duì)照組和XOS組；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，在XOS的干預(yù)下，應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠的體重得到了改善。與CUMS模型組相比，三個(gè)劑量的XOS處理分別增加了57.8%、22.9%和39.0%的體重，圖1c結(jié)果顯示，低劑量的XOS干預(yù)可以顯著改善應(yīng)激誘導(dǎo)的體重下降（P<0.01）。 （2）XOS對(duì)小鼠抑郁癥和焦慮樣行為的影響 通過SPT、TST和FST對(duì)抑郁相關(guān)行為進(jìn)行評(píng)估，表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，4周的CUMS已經(jīng)激發(fā)了小鼠的抑郁行為，模型組小鼠的蔗糖偏好指數(shù)下降（31.6%）。 如圖2a所示，用低、中、高劑量的XOS處理后，小鼠的蔗糖偏好指數(shù)分別增加了39.8%、34.4%和40.6%（P<0.05）；在TST和FST中，各種外部應(yīng)激源明顯增加了靜止時(shí)間（增加了38.9%和35.2%）（P<0.05）；圖2e和圖2f結(jié)果顯示，XOS處理顯著降低了靜止時(shí)間，特別是低、中劑量組在TST中分別降低了26.9%和34.6%（P<0.05），在FST中降低了29.3%和25.6%（P<0.01）。 如圖2b、圖2c所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間明顯減少（28.4%），進(jìn)入張開臂區(qū)域的時(shí)間顯著減少（39.8%）（P<0.05）；XOS的干預(yù)改善了探索活動(dòng)，然而，只有中劑量組顯示出顯著的差異（P<0.05）；圖2d結(jié)果顯示，所有的XOS處理組在張開臂上花費(fèi)的時(shí)間增加，但沒有顯著性差異。
（3）XOS對(duì)大腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響 如圖3所示，服用XOS后，小鼠的神經(jīng)遞質(zhì)得到改善，尤其是0.23 g kg-1 day-1的XOS實(shí)驗(yàn)組。圖3a和圖3b結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激引起的前額皮層（PFC）5-HT和5-HTP的分泌顯著增加7%和5%（P<0.05）；圖3c顯示，與模型組相比，低劑量的XOS處理增加了PFC中的GABA水平（7%）（P<0.05）；圖3d顯示，對(duì)血清中BDNF的水平進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，暴露于慢性應(yīng)激后，血清中BDNF的濃度顯著下降（P<0.05），低劑量XOS干預(yù)提高了BDNF水平，但與模型組相比沒有顯著差異。
（4）XOS對(duì)色氨酸和色氨酸代謝物的影響 如圖4所示，不同劑量的XOS干預(yù)對(duì)應(yīng)激小鼠的Trp變化有相同的影響；在XOS的干預(yù)下，色氨酸（Trp）和犬尿喹啉（Kyn）的濃度都有所增加，特別是在XOS的劑量為0.23 g kg-1 day-1時(shí)，Trp和犬尿喹啉（Kyn）的濃度分別增加了53%（P<0.05）和202%（P<0.01）。
（5）XOS對(duì)SCFA的影響 如圖5所示，對(duì)照組和模型組中SCFAs的濃度非常相似，表明4周的慢性應(yīng)激不足以引起SCFAs含量的變化，攝入XOS后，糞便中SCFAs的含量有顯著增加，說明飲食中補(bǔ)充XOS可以增強(qiáng)SCFAs的產(chǎn)生；在對(duì)照組小鼠中，乙酸鹽（39.33±3.31 μmol g-1）是最主要的SCFAs類型，占小鼠腸道細(xì)菌產(chǎn)生的SCFAs比例最高，其次是丙酸鹽（11.37±1.38 μmol g-1）、丁酸鹽（7.84±0.91 μmol g-1）和戊酸鹽（6.00±0.70 μmol g-1）；與模型組相比，低和中劑量組小鼠糞便中的乙酸鹽水平分別顯著增加91%和55%（P<0.01）；給予0.23 g kg-1 day-1的XOS，丙酸鹽和丁酸鹽的水平顯著增加81%和83%（P<0.01），中等劑量的XOS，丙酸鹽的水平也增加51%（P<0.05），但它沒有改變糞便中戊酸鹽的水平（P>0.05）。
（6）XOS對(duì)腸道微生物群組成的影響 如圖6所示，小鼠中最主要的門類仍然是厚壁菌門和擬桿菌門。圖6a顯示，在暴露于應(yīng)激和XOS干預(yù)后，每組的相對(duì)豐度僅有輕微變化，然而，在CUMS的刺激下，一些細(xì)菌有明顯的變化，例如，Verrucomicrobiota和Actinobacteria的相對(duì)豐度比對(duì)照組低，XOS干預(yù)顯著增加了應(yīng)激小鼠中Verrucomicrobiota和Actinobacteria的豐度。 如圖6b所示，Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此外，β多樣性的分析顯示，模型組的微生物群與XOS處理組的微生物群有明顯的區(qū)別，表明在飲食中補(bǔ)充XOS后，糞便微生物群的組成發(fā)生了改變，說明XOS處理可以使慢性應(yīng)激引起的腸道微生物群的改變正?；?。Lefse（線性判別分析效應(yīng)量，LDA效應(yīng)量）分析表明，模型組中Deferribacterota、Deferribacteraceae、Desulfovibrio、Deferribacterales、Deferribacteres和Mucispirillum的相對(duì)豐度顯著增加；圖6c結(jié)果顯示，在高劑量XOS處理的小鼠中，Eggerthellaceae、Enterorhabdus、Coriobacteriales、Coriobacteriia、Prevotellaceae和Prevotellaceae_UCG_001的相對(duì)豐度得到改善；圖6d顯示，在屬水平的五個(gè)組中，有五個(gè)高度不同的相對(duì)豐度，包括Muribaculaceae_norank、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Akkermansia和Clostridia_UCG014_norank。
如圖7所示，與對(duì)照組相比，模型組的Akkermansia的相對(duì)豐度明顯下降（P<0.05），在0.50 g kg-1 day-1 XOS的干預(yù)下，其相對(duì)豐度增加（226%）；與模型組相比，脫硫弧菌的相對(duì)豐度顯著增加（P<0.05），而XOS的干預(yù)緩解了慢性應(yīng)激引起的相對(duì)豐度的增加；在丁酸鹽產(chǎn)生菌中，Roseburia（P<0.05）和Eubacterium_xylanophilum_group（P<0.01）在0.50 g kg-1 day-1 XOS的干預(yù)下可以顯著增加，此外，腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的相對(duì)豐度也顯著增加（P<0.05）。
試驗(yàn)結(jié)論 本研究基于慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥小鼠模型為研究對(duì)象，探究不同劑量的XOS對(duì)情緒和行為的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示0.23和0.50 g kg-1 day-1劑量的XOS能夠顯著提高懸尾和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中的蔗糖偏好指數(shù)，并降低了靜止時(shí)間；同時(shí)0.23 g kg-1 day-1劑量的XOS能夠顯著增加神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，如5-羥色胺和γ-氨基丁酸；此外，對(duì)XOS干預(yù)下的糞便微生物群的分析顯示，阿克曼氏菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的相對(duì)豐度較高，脫硫弧菌屬較少，且SCFA濃度顯著增加。以上結(jié)果表明膳食補(bǔ)充XOS可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和逆轉(zhuǎn)小鼠腸道微生物群的變化來改善慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為，表明XOS是一種潛在的靶向腸道微生物群的益生元，可用于改善情緒障礙。
參考資料： Shu X , Tong Y , Yang R .Administration of xylo‐oligosaccharides improves depressive‐like behaviour in mice caused by chronic unpredictable mild stress by altering microbiota composition[J].International Journal of Food Science and Technology, 2022, 57(7):4222-4233. |
