 試驗設(shè)計 試驗對象：40只6周齡的雄性C57BL/6J小鼠（平均體重21.2±0.2克），購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。 動物處理：將小鼠分為正常組、載體組、XOS-H組和XOS-L組，每組有10只小鼠，正常組喂食基礎(chǔ)飲食（12.79%脂肪，66.67%碳水化合物，20.54%蛋白質(zhì)），其余小組給予高脂飲食（60.65%脂肪，21.22%碳水化合物，18.14%蛋白質(zhì)）以及給予XOS-L（250 mg/kg（b·w））和XOS-H（500 mg/kg（b·w））組，灌胃劑量為10 mL/kg，其他組給予相同數(shù)量的正常鹽水，實驗持續(xù)12周，每周對小鼠稱重。灌胃干預(yù)后，收集血液、肝臟、附睪脂肪、小腸組織和盲腸內(nèi)容物并儲存在-80℃。 附睪脂肪測定：附睪脂肪指數(shù)=附睪脂肪量（g）/小鼠體質(zhì)量（g）×100。 生物化學(xué)分析：用試劑盒分析血清中TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的水平。 酶聯(lián)免疫吸附試驗：采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒分析血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。 組織學(xué)分析：分析肝臟和附睪脂肪的脂肪細(xì)胞直徑，與正常組的相對脂肪細(xì)胞大小進(jìn)行比較。 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)：選擇正常組、載體組、高劑量和低劑量低聚木糖組小鼠的肝臟和附睪脂肪作為脂質(zhì)代謝相關(guān)關(guān)鍵基因的檢測對象，實時逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析XOS在轉(zhuǎn)錄水平上對小鼠脂質(zhì)代謝途徑的影響。小腸組織被用來確定緊密連接（TJ）蛋白的相對表達(dá)，即閉合蛋白、Claudin-1和zonula occluden-1（ZO-1）。從肝臟、附睪脂肪和小腸組織中提取RNA，測定RNA濃度，然后將高質(zhì)量的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)熒光定量PCR，以β-肌動蛋白基因為參考基因，采用2-ΔΔCt相對定量法計算各組基因的表達(dá)量。 蛋白質(zhì)印跡分析：稱量肝臟組織（100毫克），用試劑盒提取蛋白，對蛋白濃度進(jìn)行量化，蛋白質(zhì)變性后進(jìn)行電泳，使用iBright FL1000成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像顯影，最后使用ImageJ軟件對蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行量化。 盲腸內(nèi)容物中選定腸道菌群的相對豐度：采用糞便基因組DNA提取試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中提取DNA進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，確定各組小鼠腸道中乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、羅斯氏菌屬、厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度。 試驗結(jié)果 （1）動物實驗中的體重和附睪脂肪變化 如圖1A和1B所示，在12周期間，喂食基礎(chǔ)飲食的正常小鼠的體重平均從21克增加到25克，體重增加率為19%；喂食高脂飲食的載體小鼠的體重從22克增加到32克，體重增加率為45%；與載體組相比，在XOS干預(yù)12周后，XOS-H組小鼠的體重顯著減少16.32%。此外，如圖1C和1D所示，載體組的附睪脂肪指數(shù)最大，脂肪堆積量也最大；在高、低劑量XOS干預(yù)12周后，小鼠的附睪脂肪分別減少了54.2%和48.3%，表明XOS可以減少高脂飲食引起的脂肪堆積。
（2）血脂和脂蛋白水平 如表1所示，喂養(yǎng)12周后，與正常組相比，載體組的TG、TC和LDL-C含量分別顯著增加了67.8%、47.4%和129.4%，表明高脂飲食成功地誘發(fā)了小鼠血脂異常；補(bǔ)充XOS可減輕血脂和脂蛋白水平，XOS-H組的TG、TC和LDL-C水平分別下降了45.7%、21.9%和41.0%。然而，在喂食高脂飲食的小鼠中，XOS并沒有顯著增加HDL-C的水平。
（3）血清AST和ALT活性 如圖2所示，ALT和AST作為體內(nèi)重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志物。與正常組小鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)的載體組小鼠血清中的ALT和AST活性顯著增加（P＜0.05），說明高脂飲食對小鼠的肝臟造成了一定程度的損傷；XOS的干預(yù)有效地抑制了高脂飲食引起的ALT和AST活性的增加，緩解了肝臟損傷。
（4）血清細(xì)胞因子水平 如圖3所示，處理12周后，載體組小鼠血清中IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-1β的水平最高，IL-10的水平最低，而正常組小鼠則呈現(xiàn)相反的趨勢；XOS降低了炎癥刺激對小鼠的影響，包括血清炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平下降，IL-10水平上升。然而，在不同劑量的XOS的干預(yù)下，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。結(jié)果表明XOS增加了抗炎因子IL-10的水平，降低了血清中促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，從而對高脂血癥小鼠的血脂水平發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。
（5）組織病理學(xué)分析 如圖4A所示，正常組未見脂肪變性，組織結(jié)構(gòu)清晰，同時肝細(xì)胞有豐富的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜清晰，排列規(guī)則，中心有大而正常的細(xì)胞核；如圖4B所示，在載體組的肝細(xì)胞中可以看到不同形狀的脂滴，細(xì)胞之間的界限也很模糊；在XOS干預(yù)后，小鼠肝細(xì)胞中脂肪泡的密度降低，脂滴更小、更分散、更稀少；如圖4C和4D所示，細(xì)胞核位于細(xì)胞中心，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本正常，有逐漸恢復(fù)到正常肝細(xì)胞的趨勢。同時，對肝組織中TG含量的測定也證實高脂飲食使肝臟中TG含量顯著增加（P＜0.05）；如圖4E所示，XOS的干預(yù)抑制了TG在肝臟中的積累，而高劑量XOS的效果更為明顯，這表明XOS改善了肝臟脂質(zhì)的積累。
如圖5A-5E所示，正常組的附睪脂肪中的脂肪細(xì)胞大小均勻，排列整齊，密度大；然而載體組的脂肪細(xì)胞是肥大的，排列松散，有些細(xì)胞甚至比正常組的脂肪細(xì)胞大一倍。對高脂血癥小鼠灌胃不同劑量的XOS后，附睪脂肪細(xì)胞的外觀得到改善，脂肪細(xì)胞變小，結(jié)構(gòu)更緊密，特別是高劑量的XOS顯著減少了脂肪細(xì)胞的肥大。如圖5E所示，證實高脂飲食顯著增加了（P<0.001）脂肪細(xì)胞的直徑，而XOS明顯改善了這一趨勢（P<0.001），這與正常組的結(jié)果接近。
（6）小鼠附睪脂肪組織中RNA的表達(dá)情況 如圖6所示，初步探討了XOS的調(diào)脂活性機(jī)制，通過RT-qPCR測定附睪脂肪組織中AMPK、ACC、CPT-1、C/EBPα、LPL和PPAR-α的基因表達(dá)。在正常小鼠樣本中，AMPK、CPT-1和PPAR-α表達(dá)水平最高，而ACC、C/EBPα和LPL表達(dá)水平最低；載體組小鼠樣本則完全顯示出相反的趨勢；灌胃250和500 mg/kg的XOS逆轉(zhuǎn)了高脂飲食小鼠的基因表達(dá)，抑制了AMPK、CPT-1和PPAR-α的下調(diào)以及ACC、C/EBPα和LPL的上調(diào)；其中高劑量XOS的作用更強(qiáng)，小鼠附睪脂肪中相關(guān)基因的表達(dá)更接近于正常小鼠。
（7）小鼠肝臟組織中RNA的表達(dá) 如圖7所示，我們研究了肝臟組織中參與脂肪生成、脂肪酸氧化和膽固醇代謝的基因的mRNA表達(dá)。與正常組相比，載體組的AMPK mRNA表達(dá)明顯減少（P<0.001）；在XOS灌胃干預(yù)后，AMPK表達(dá)增加，表明XOS干預(yù)激活了AMPK途徑，增加了AMPK表達(dá)。激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)脂肪酸代謝可能與AMPK同時參與機(jī)體分解和合成代謝的能力有關(guān)。高脂飲食增加了脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，包括ACC、C/EBPα和PPAR-γ，但灌胃XOS則顯著降低了它們的表達(dá)。同時，在XOS干預(yù)后，脂肪酸β-氧化相關(guān)基因（PPAR-α和CPT-1）在mRNA水平的表達(dá)增加。此外，高脂飲食降低了小鼠膽汁酸合成CYP7A1基因的表達(dá)。補(bǔ)充XOS增加了CYP7A1的表達(dá)，促進(jìn)了膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化。
（8）小鼠小腸組織中RNA的表達(dá) 如圖8所示，高脂肪飲食對腸道黏膜有負(fù)面的調(diào)節(jié)作用，增加了破壞腸道屏障的細(xì)胞因子水平，并增加了破壞腸道屏障的菌群中的物種數(shù)量；因此通過RT-qPCR檢測了實驗小鼠腸道TJ蛋白o(hù)ccludin、claudin-1和ZO-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與其他組相比，載體組的腸道中occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量較低；不同劑量的XOS使occludin、Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量增加。
（9）蛋白質(zhì)在小鼠肝臟組織中的表達(dá) 如圖9所示，蛋白質(zhì)印跡分析檢測了小鼠肝臟中蛋白質(zhì)的表達(dá)，高脂飲食降低了CYP7A1和PPAR-α的蛋白表達(dá)，增加了PPAR-γ和C/EBPα的蛋白表達(dá)；XOS-H干預(yù)顯著抑制了PPAR-γ（p < 0.01）和C/EBPα（p < 0.001）表達(dá)的上調(diào)，以及PPAR-α表達(dá)的下調(diào)；XOS有增加CYP7A1表達(dá)的趨勢，但影響不大。
（10）小鼠糞便中微生物RNA的表達(dá) 如圖10所示，以細(xì)菌總DNA為內(nèi)參，各組小鼠盲腸中的厚壁菌門、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、羅伊氏菌屬、擬桿菌的相對表達(dá)，RT-qPCR結(jié)果顯示高脂飲食增加了厚壁菌門、擬桿菌門的豐度，同時降低了乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和羅伊氏菌屬的豐度，高脂飲食組厚壁菌門的豐度顯著增加（P<0.01），是正常飲食組的5.55倍；擬桿菌、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和羅伊氏菌屬的豐度分別比正常飲食組下降0.43、0.01、0.17和0.61倍。在XOS干預(yù)后，特別是較高劑量的XOS，厚壁菌門的豐度下降了0.29倍，而擬桿菌、乳酸菌屬和雙歧桿菌屬的豐度分別增加了1.81、63.33和8.06倍。然而，由于樣本數(shù)量不足，這種差異可能不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
試驗結(jié)論 本研究旨在研究XOS對喂食高脂飲食小鼠的影響，給小鼠分別喂食正常飲食或補(bǔ)充了XOS（250和500mg/kg）的高脂飲食，喂食12周，結(jié)果顯示XOS抑制了小鼠體重增加，降低了附睪脂肪指數(shù)，并改善了血脂水平，包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。XOS降低了谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性，減輕了高脂飲食對肝臟的損傷；XOS還能降低高脂血癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)。此外，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示XOS干預(yù)激活了AMP活化蛋白激酶（AMPK）途徑，以調(diào)節(jié)脂肪的合成、分解和β氧化；上調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）和膽固醇7-α羥化酶（CYP7A1）的mRNA表達(dá)水平；下調(diào)乙酰輔酶a羧化酶（ACC）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）、脂蛋白脂酶（LPL）mRNA表達(dá)水平。另一方面，XOS提高了小腸中zonula occludens-1（ZO-1）、occludin和claudin-1的mRNA表達(dá)水平，增加了腸道屏障的強(qiáng)度，并優(yōu)化了腸道微生物群的組成，以上結(jié)果表明XOS具有改善高脂血癥的治療潛力。
參考資料： Campbell J M , Jr F G , Wolf B W .Selected indigestible oligosaccharides affect large bowel mass, cecal and fecal short-chain fatty acids, pH and microflora in rats.[J].Journal of Nutrition, 1997, 127(1):130-136. |
