低聚糖：低聚異麥芽糖（IMO）；棉子糖；低聚木糖（XOS）；菊粉；低聚果糖；甘露寡糖（MOS）；乳果糖；D-纖維二糖；菌株：植物乳桿菌菌株（ZS2058、T和ST-III）、鼠李糖乳桿菌GG（LGG）和鼠傷寒沙門氏菌SL1344（SL1344）。
測定乳酸菌在低聚糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基中的生長情況：將低聚糖或葡萄糖添加到無葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，最終濃度為20 g/L；將過夜的乳酸菌（0.1毫升）接種到這些培養(yǎng)基中，并在37℃下培養(yǎng)36小時，使用分光光度計每2小時測量一次OD600值，持續(xù)36小時（n=3），比較不同培養(yǎng)基中植物乳桿菌ZS2058的最終OD600值（以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示），不同上標(biāo)字母的數(shù)值有顯著差異，P＜0.05。 動物實驗設(shè)計：選擇6-7周齡、無特異性病原體（SPF）的C57BL/6雌性小鼠為研究對象，在溫度22±2℃，濕度55±5%的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h。本研究中包括三個動物實驗（圖1），實驗方案如下： 實驗1：將135只小鼠分為9組（n=15），對照組和模型組接受常規(guī)飲食，每天灌胃0.1 mL PBS；ZS2058組接受常規(guī)飲食，每天灌胃0.1 mL PBS-重懸的植物乳桿菌ZS2058（5.0×109 CFU/mL）；其他組接受低聚糖或葡萄糖補(bǔ)充的飲食（1% w/w），并每天灌胃L. plantarum ZS2058，預(yù)處理10天后，小鼠（除對照組外）通過灌胃感染S. Typhimurium SL1344（1.0×106 CFU），并在感染后18天內(nèi)監(jiān)測存活率。 實驗2：將另外150只小鼠分為15組（n=10），其中9組按上述方法處理，余下6組接受低聚糖或葡萄糖補(bǔ)充飲食（1% w/w），每天灌胃0.1 mL PBS，預(yù)處理10天后，收集小鼠糞便，用S. Typhimurium SL1344（1.0×106 CFU）感染小鼠（對照組除外），并監(jiān)測其存活率。 實驗3：將25只小鼠分為5組（n=5），分別為對照組、模型組、ZS2058組、XOS組和XOS+ZS2058組，均如上所述進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理10天后，使小鼠（除對照組外）感染沙門氏菌，感染后的小鼠在2 DPI時在二氧化碳安樂死系統(tǒng)中實施安樂死，收集血清、盲腸內(nèi)容物和肝臟，并在-80℃下保存，直到使用。
低聚糖對植物乳桿菌ZS2058的拮抗活性的影響：在pH值為7.2的BHI培養(yǎng)基中加入低聚糖或葡萄糖（2 g/L），將乳酸菌和鼠傷寒沙門氏菌SL1344的過夜培養(yǎng)物洗凈并重新懸浮在0.1 M PBS（pH6.2）中，將100 μL PBS中的約1.0×108個CFU細(xì)菌接種到不同的培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)18小時，然后用PBS連續(xù)稀釋共培養(yǎng)物的懸浮液，并在補(bǔ)充有鏈霉素的LB瓊脂上鍍上濃度為50 μg/mL的鏈霉素，對沙門氏菌的CFUs進(jìn)行計數(shù)和記錄。 糞便中SCFAs濃度的測定：收集小鼠糞便，冷凍干燥后進(jìn)行稱重，隨后，將糞便浸泡在飽和氯化鈉中，用硫酸水溶液和二乙醚分別進(jìn)行酸化和提取處理，檢測SCFAs濃度。 細(xì)胞因子的測定：將新鮮肝臟在放射免疫沉淀試驗（RIPA）裂解緩沖液中以1：10（m/v）的稀釋度勻漿，然后用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測這些勻漿中各種細(xì)胞因子、組織壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-6的水平。 16S rDNA測序和生物信息學(xué)分析：從小鼠糞便內(nèi)容物中提取并純化微生物DNA，然后通過PCR擴(kuò)增16S rDNA的V4區(qū)，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳、用QIA快速凝膠提取試劑盒進(jìn)行凝膠提取、定量和文庫制備后進(jìn)行測序。 試驗結(jié)果 （1）低聚糖對植物乳桿菌生長的不同影響 如圖2A-E所示，與普通MRS培養(yǎng)基相比，在FOS、乳果糖和D-纖維二糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基中生長的植物乳桿菌菌株表現(xiàn)出相似的快速生長，最終OD600值很高；植物乳桿菌菌株，特別是ZS2058和ST-III，在棉子糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基中生長得更慢；圖2F-I顯示在IMO、MOS、菊粉和XOS補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，所有測試菌株的OD600值都低很多，以上表明不同的低聚糖對L. plantarum ZS2058的生長有不同的影響。
（2）XOS促進(jìn)了植物乳桿菌ZS2058對沙門氏菌感染的預(yù)防作用 如圖3A、圖3B所示，用低聚糖和植物乳桿菌ZS2058處理并沒有引起感染小鼠體重和飲食攝入量的顯著變化；圖4A顯示，在感染后18天（DPI），發(fā)現(xiàn)只有XOS能顯著提高ZS2058處理小鼠的存活率（66.7% vs. 53.3%），而其他低聚糖會降低存活率（FOS：46.7%；棉子糖：26.7%；MOS：26.7%；菊粉：40%）；圖4B顯示，接受XOS補(bǔ)充飲食的小鼠在18 DPI時的存活率與模型組相同，而XOS+ZS2058組則增加了38%，其他低聚糖或其與植物乳桿菌ZS2058的組合并沒有比ZS2058組表現(xiàn)更好，以上結(jié)果表明XOS促進(jìn)了植物乳桿菌ZS2058對沙門氏菌感染的預(yù)防作用，而不是發(fā)揮了協(xié)同作用。
（3）在體外共培養(yǎng)體系中，XOS能顯著提高植物乳桿菌ZS2058對沙門氏菌的拮抗活性 由表2可知，在BHI培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門氏菌SL1344的細(xì)胞密度在培養(yǎng)24小時后達(dá)到12.73×108 CFU/mL，它的生長被XOS（5.20×108 CFU/mL）、乳果糖（7.67×108 CFU/mL）和D-纖維二糖（9.20×108 CFU/mL）顯著抑制，相反棉子糖顯著增加了鼠傷寒沙門氏菌SL1344的生長，而菊粉、FOS、MOS和IMO沒有顯示出明顯的影響。植物乳桿菌ZS2058顯示出拮抗活性，將鼠傷寒沙門氏菌SL1344的細(xì)胞密度從12.73×108 CFU/mL降低到10.73×108 CFU/mL，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)充XOS進(jìn)一步降低了沙門氏菌的細(xì)菌數(shù)量，使其達(dá)到更低的水平（1.01×108 CFU/mL），這一結(jié)果表明，在體外共培養(yǎng)體系中，XOS顯著促進(jìn)了植物乳桿菌ZS2058對沙門氏菌的拮抗活性，這可能有助于增強(qiáng)植物乳桿菌ZS2058的抗沙門氏菌活性，除棉子糖以外的低聚糖，也促進(jìn)了植物乳桿菌ZS2058的拮抗活性，但圖1A和圖1B的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，植物乳桿菌ZS2058的益生菌作用沒有被這些低聚糖所促進(jìn)。
（4）XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合顯著增加了糞便中SCFAs的含量 如圖5A、圖5B所示，經(jīng)XOS處理的小鼠乙酸和丙酸的含量有輕微但不顯著的增加；圖5A-C顯示，XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合顯著增加了乙酸、丙酸和丁酸的水平，且其他低聚糖和它們與植物乳桿菌ZS2058的組合并沒有引起任何測試的SCFAs的顯著變化，以上結(jié)果表明，盡管SCFAs的含量不受植物乳桿菌ZS2058或低聚糖預(yù)處理的影響，但XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合顯著增加了SCFAs的產(chǎn)生。
（5）XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合恢復(fù)了肝臟中的炎癥反應(yīng) 如圖6所示，感染小鼠（模型）的IL-6、TNF-α和IL-1β的水平都有所下降，但XOS和植物乳桿菌ZS2058（XOS+ZS2058）的組合則顯著增加，且發(fā)現(xiàn)沙門氏菌也可以減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制促炎性細(xì)胞因子也可能有助于病原體逃避宿主的免疫監(jiān)視，實現(xiàn)全身感染。XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合顯著增加了IL-6、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生；對于植物乳桿菌ZS2058處理的小鼠，這些促炎細(xì)胞因子的水平與模型組相當(dāng)，而XOS處理只增加TNF-α的水平，以上結(jié)果表明肝臟中的炎癥反應(yīng)被沙門氏菌所抑制，并通過XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合得到恢復(fù)。
（6）XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合通過靶向特定的細(xì)菌來改變腸道微生物群 如圖7A所示，在基因組比對和注釋后，主成分分析（PCA）顯示，XOS、植物乳桿菌 ZS2058和它們的組合將腸道微生物群重新編程為不同的輪廓，進(jìn)一步分析菌屬水平的相對豐度，表明沙門氏菌感染改變了腸道微生物群的結(jié)構(gòu)。 如圖7B顯示，XOS、植物乳桿菌 ZS2058和它們的組合對細(xì)菌的相對豐度產(chǎn)生了不同的影響；圖7C顯示，Sutterella、Bilophila和f_Peptostreptococcaceae_g是代表腸道微生物群變化的最佳候選細(xì)菌，感染小鼠中Sutterella和Bilophila的相對豐度顯著降低，XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合使這些細(xì)菌的相對豐度恢復(fù)到與對照小鼠相當(dāng)?shù)乃健?/span> 如表3可知，f_Peptostreptococcaceae_g（屬于Peptostreptococcaceae的一個屬）細(xì)菌在受感染的小鼠中從0.1428%增加到0.2504%，并植物乳桿菌ZS2058和XOS處理后分別增加到1.2957%和0.3671%，用XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合處理，將其相對豐度降低到0.1020%（表3）。 如圖7D顯示，不同的處理方法使腸道微生物群在不同的類群（門到屬）發(fā)生了顯著的變化，Deferribacteres（門）、Deferribacteres（類）、Deferribacterales（目）、Deferribacteraceae（科）和Mucispirillum（屬）被確定為用XOS和植物乳桿菌ZS2058聯(lián)合處理的小鼠的標(biāo)記菌，Mucispirillum屬屬于其他四個分類群，因此，Mucispirillum可以作為XOS和植物乳桿菌 ZS2058組合改變腸道微生物群的一個特殊目標(biāo)。
試驗結(jié)論 本文研究低聚糖的膳食補(bǔ)充和它們對植物乳桿菌ZS2058抗沙門氏菌活性的影響，結(jié)果表明在所研究的五種低聚糖中，只有低聚木糖（XOS）能顯著提高植物乳桿菌ZS2058處理的鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的存活率；在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中，XOS顯著促進(jìn)了植物乳桿菌ZS2058對沙門氏菌的拮抗活性（增加92%）；XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合顯著增加了沙門氏菌感染的小鼠糞便中的短鏈脂肪酸（SCFAs）含量，且XOS、植物乳桿菌ZS2058及其組合使腸道菌群呈現(xiàn)出明顯的分布特征。以上結(jié)果表明低劑量的XOS和植物乳桿菌ZS2058的組合對預(yù)防沙門氏菌感染有很大的潛力。 參考資料： Wei Z H J W S F X J L .Dietary supplementation with low-dose xylooligosaccharide promotes the anti-Salmonella activity of probiotic Lactiplantibacillus plantarum ZS2058 in a murine model[J].Food Research International,2022. |
