試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)材料：干酪乳桿菌LZ183E、海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉和谷氨酸鈉。 凍干菌劑的制備：將保存的LZ183E菌液在MＲS液體培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜活化3代，把活化后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LZ183E以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于優(yōu)化后的MＲS培養(yǎng)基中，37℃高密度培養(yǎng)30 h，獲得菌液備用；在無(wú)菌的條件下，取2 mL菌液于10 mL無(wú)菌離心管中，8000 r/min、4℃離心3 min，然后用滅菌生理鹽水進(jìn)行2次清洗，得到菌泥，再向含菌泥的10 mL離心管中加入2 mL已配制的凍干保護(hù)液，于－80℃冰箱中凍存6 h，然后迅速放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h以上，直至菌液凍干呈顯棉絮狀，得到凍干菌劑，此過(guò)程保持無(wú)菌。 單一組分的凍干保護(hù)劑用量的確定：通過(guò)單因素試驗(yàn)考察海藻糖、脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉等保護(hù)劑的用量對(duì)LZ183E在冷凍過(guò)程中存活率的影響；制備凍干菌劑時(shí)，控制真空冷凍干燥機(jī)條件不變，以菌株存活率和菌劑產(chǎn)酸能力為指標(biāo)，探究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的海藻糖（2%、4%、6%、8%、10%）、低聚木糖（2%、4%、6%、8%和10%）、脫脂乳粉（2%、6%、10%、14%和18%）、谷氨酸鈉（0.5%、1.0%、1.5%、2．0%和2.5%）對(duì)菌株LZ183E在凍干以后活力的影響，確定其適宜的濃度范圍，并以未加保護(hù)劑為空白對(duì)照組（CK組）。 復(fù)配保護(hù)劑的響應(yīng)面法優(yōu)化：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌株存活率為指標(biāo)，選取對(duì)菌株活性影響顯著的3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，確定保護(hù)劑的最佳配比。 測(cè)定方法：測(cè)定LZ183E在冷凍過(guò)程中的活菌數(shù)，再將凍干菌粉按原比例復(fù)溶進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算凍干前后菌株存活率；將凍干后的菌劑以3%的接種量加入滅菌后的脫脂牛奶中，37℃發(fā)酵12 h后測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）海藻糖用量對(duì)菌劑活力的影響 由圖1可知，海藻糖用量在2%～10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)LZ183E在凍干過(guò)程的保護(hù)作用無(wú)顯著差異（P＞0.05），菌株存活率處于波動(dòng)狀態(tài)，但凍干后菌株LZ183E仍然維持較高活力，其存活率在（93.479±1.667）%～（97.326±0.25）%，顯著高于CK組（P＜0.05）。當(dāng)海藻糖用量在6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，對(duì)菌株的保護(hù)效果最好，并且此時(shí)菌劑的產(chǎn)酸能力也對(duì)應(yīng)較強(qiáng)，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳的pH相對(duì)較低，為4.572±0.002，因此當(dāng)海藻糖添加量為6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用較好。
（2）低聚木糖用量對(duì)菌劑活力的影響 由圖2可知，隨著低聚木糖用量的增加，LZ183E在凍干后的存活率表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的添加量時(shí)具有最高存活率（96.081±0.395）%，明顯高于CK組；尤其當(dāng)用量從2%升至6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，菌株存活率顯著升高（P＜0.05），而此后隨著用量進(jìn)一步增大，其存活率的增加或降低并不顯著（P＞0.05），表明低聚木糖在低濃度時(shí)其保護(hù)效果具有濃度差異性，而當(dāng)過(guò)高時(shí)已經(jīng)飽和對(duì)菌株的保護(hù)效果不明顯；此外，菌劑在產(chǎn)酸能力上，隨著低聚木糖用量的升高也表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵12 h后發(fā)酵乳pH可降低至4.5以下，這進(jìn)一步表明低聚木糖可作為益生因子而促進(jìn)LAB的生長(zhǎng)代謝，因此，當(dāng)?shù)途勰咎翘砑恿繛?0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用較好。
（3）脫脂乳粉用量對(duì)菌劑活力的影響 由圖3可知，脫脂乳粉的保護(hù)作用存在用量依賴(lài)性，隨脫脂乳粉用量的增加，LZ183E的存活率緩慢上升，在10%～14%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）趨于穩(wěn)定，此時(shí)菌株存活率高于97%，而當(dāng)高于14%的用量時(shí)存活率急劇下降（P＜0.05），但仍然高于CK組；且菌劑的產(chǎn)酸能力也表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)關(guān)系，菌株存活率越高，產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，因此，當(dāng)脫脂乳粉添加量為10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用較好。
（4）谷氨酸鈉用量對(duì)菌劑活力的影響 由圖4可知，谷氨酸鈉用量在0.5%～1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)菌株保持著高于95%的存活率，當(dāng)用量大于1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)干菌株存活率顯著下降（P＜0.05），并且用量在2．5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)存活率最低，為（85.758±0.949）%，已經(jīng)接近CK組，對(duì)菌株的保護(hù)作用表現(xiàn)出明顯不足。此時(shí)產(chǎn)酸能力也相對(duì)較弱，但對(duì)整體產(chǎn)酸能力影響不大，因此，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)對(duì)菌株的保護(hù)作用較好。
（5）復(fù)配保護(hù)劑的響應(yīng)面分析法優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，控制海藻糖用量為6%，以L(fǎng)．casei LZ183E存活率為指標(biāo)，進(jìn)一步對(duì)低聚木糖、脫脂乳粉以及谷氨酸鈉復(fù)配用量進(jìn)行優(yōu)化，其Box-Behnken設(shè)計(jì)表及結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。
軟件Design Expert V 10對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合的回歸方程為Y=98.2268+0.55125X1－0.320125X2－0.350875X3－1.063X1X2－0.1345X1X3－0.05775X2X3－1.346275X12－1.087025X22－0.207525X32，其方差分析結(jié)果如表3所示。 由表3可知，本實(shí)驗(yàn)建立的模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），因此模型可靠性較高；并且Ｒ2=0.9125，說(shuō)明脫脂乳粉、低聚木糖和谷氨酸鈉對(duì)LZ183E存活率的影響顯著；信噪比（signal-to-noise，S/N）=8.7284＞4，也從另一角度說(shuō)明所建立的模型是可靠的；經(jīng)方差分析，3個(gè)因素對(duì)凝固型發(fā)酵牛乳影響的主次順序?yàn)閄1＞X3＞X2，即脫脂乳粉用量＞谷氨酸鈉用量＞低聚木糖用量；研究表明，響應(yīng)面的等高線(xiàn)越偏向橢圓，因素間交互作用越強(qiáng)；并且其呈現(xiàn)在閉合的橢圓或圓形，表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)有最值。
由圖5可知，當(dāng)谷氨酸鈉用量保持不變時(shí)，隨著脫脂乳粉和低聚木糖用量的升高，菌株存活率均表現(xiàn)為先升后降，脫脂乳粉用量在8.5%～13.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和低聚木糖量在6%～10.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）較為適宜；等高線(xiàn)呈現(xiàn)閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，表明脫脂乳粉用量和低聚木糖用量交互作用顯著，并且此區(qū)間內(nèi)有最大值；當(dāng)?shù)途勰咎怯昧坎蛔儠r(shí)，隨著脫脂乳粉和谷氨酸鈉用量的增大，菌株存活率也表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，脫脂乳粉用量在8.7%～13.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和谷氨酸鈉用量在0.3%～1.75%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）較佳；此范圍內(nèi)等高線(xiàn)為閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，說(shuō)明脫脂乳粉用量和谷氨酸鈉用量交互作用有最大值；當(dāng)脫脂乳粉用量不變時(shí)，隨低聚木糖和谷氨酸鈉用量的增加，菌株存活率同樣表現(xiàn)為先增后降的趨勢(shì)，低聚木糖用量在7.1%～11.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），谷氨酸鈉用量在0.4%～18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）較佳；此時(shí)等高線(xiàn)的形狀為閉合橢圓且響應(yīng)面為凸形，說(shuō)明在此區(qū)間內(nèi)低聚木糖和谷氨酸鈉交互作用強(qiáng)，并具有最大值；上述分析和表3中的顯著性一致。
試驗(yàn)結(jié)論 在高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以干酪乳桿菌LZ183E為研究對(duì)象，菌株存活率和菌劑產(chǎn)酸能力為響應(yīng)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察4種保護(hù)劑（海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉和谷氨酸鈉）用量對(duì)菌株活力的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)條件下的菌劑的活力和產(chǎn)酸能力作出評(píng)價(jià)；結(jié)果表明，海藻糖、低聚木糖、脫脂乳粉以及谷氨酸鈉對(duì)干酪乳桿菌LZ183E在凍干過(guò)程中有明顯的保護(hù)效果，并且其最佳復(fù)配參數(shù)為海藻糖用量6.0%、低聚木糖用量8.5%、脫脂乳粉用量11.5%和谷氨酸鈉用量1.0%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），此條件下菌株存活率為（98.236±0.137）%，顯著高于未加保護(hù)劑的菌劑的存活率（79.241±0.382）%；在此最優(yōu)配比下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株的存活率為（98.236±0.137）%，接近模型的預(yù)測(cè)值，證明此模型是可靠的。
參考資料： 周佳豪,雷文平,劉成國(guó),周輝,周杏榮,葉望娟.高活菌數(shù)干酪乳桿菌LZ183E凍干保護(hù)劑的制備[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46(24):138-143. |
