 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 糞便樣本的來源：5名經(jīng)結(jié)腸鏡診斷為臨床緩解期的UC患者和5名健康志愿者，年齡在18至60歲之間，被納入這項(xiàng)病例對(duì)照研究。 發(fā)酵培養(yǎng)基：基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基（酵母提取物、卡西酮和脂肪酸；YCFA）包含以下化合物：胰蛋白酶，10g/L；酵母提取物，2. 5克/升；L-半胱氨酸，1克/升；NaCl，0.9克/升；CaCl2-6H2O，0.09克/升；KH2PO4，0.45克/升；K2HPO4，0.45克/升；MgSO4-7H2O，0.09克/升；維生素I溶液，200毫升；赫敏溶液，2毫升；加入XOS（Sigma Aldrich，美國）（8克/升）作為唯一的碳源。在加入?yún)捬鯒l件的指示劑后，將培養(yǎng)基調(diào)整到pH值6.5，并將5毫升分裝到一個(gè)10毫升的瓶子里，在高壓滅菌器中消毒前用N2沖洗。 靜態(tài)發(fā)酵：采集研究對(duì)象新鮮的糞便樣品（0.8克）用8毫升0.1M厭氧磷酸鹽緩沖鹽水（pH7.0）均質(zhì)，在糞便樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即制成10%（w/v）的泥漿。 將0.5毫升的糞便漿液接種到裝有5毫升生長培養(yǎng)基（XOS作為唯一的碳源）的消毒瓶中，在37℃下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48小時(shí)后，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行離心。將培養(yǎng)基的沉淀物儲(chǔ)存在-80℃，用于提取DNA、測(cè)序及生物信息學(xué)分析。UC患者和健康志愿者的原始糞便被定義為U_FAE和N_FAE組的樣本，而UC患者在YCFA和含XOS的培養(yǎng)基中的糞便發(fā)酵沉淀樣本被定義為U_Y和U_XOS組的樣本。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）測(cè)序數(shù)據(jù) 如圖1所示，在N_FAE和U_FAE組中分別發(fā)現(xiàn)了359個(gè)和329個(gè)OTU，而在U_Y和U_XOS組中分別發(fā)現(xiàn)了320和313個(gè)OUT；在所有四個(gè)組中共檢測(cè)到235個(gè)核心OUT；另外，N_FAE組有最多的獨(dú)特物種（52種），U_FAE、U_Y和U_XOS組中分別有7、4和4個(gè)獨(dú)特物種；UC患者和健康志愿者的腸道微生物群中大多數(shù)物種可以通過靜態(tài)發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)，這意味著這種腸道微生物群的體外模擬系統(tǒng)是可行的。
（2）α-多樣性分析 物種豐富度和多樣性可以通過測(cè)量α-多樣性來評(píng)估，通常使用四種指數(shù)來評(píng)估：ACE和Sobs代表物種豐富度指數(shù)，而Shannon和Simpson代表物種多樣性指數(shù)。如圖2所示，緩解期UC患者的四個(gè)指數(shù)都低于健康志愿者，但這些差異并不顯著；此外，α-多樣性在發(fā)酵后有所下降，尤其是在U_XOS組（盡管同樣并不顯著，P>0.05）；這一結(jié)果表明，發(fā)酵可能會(huì)抑制某些細(xì)菌的生長，而有些細(xì)菌則表現(xiàn)出過度生長，尤其是在XOS的作用下?？偟膩碚f，XOS發(fā)酵不能改善UC患者腸道微生物群的α-多樣性降低。
（3）β-多樣性分析 β-多樣性分析是通過計(jì)算Bray-Curtis距離矩陣來揭示四組之間的差異，其顯著性由ANOSIM來檢驗(yàn)。如圖3所示，根據(jù)PCA，四個(gè)組顯示出明顯的分離，ANOSIM確定的P值為0.001，這意味著四個(gè)組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；更重要的是在PCoA中也觀察到類似的趨勢(shì)；對(duì)所有樣品的分析表明發(fā)酵對(duì)微生物群的組成有重大影響，因?yàn)閮蓚€(gè)FAE組和兩個(gè)發(fā)酵組表現(xiàn)出明顯的分離。
（4）群落柱狀圖分析 如圖4所示，在門水平上，N_FAE樣品比U_FAE組含有更多的放線菌門和更少的變形菌門。此外，U_XOS組比U_Y組檢測(cè)到更多的放線菌門和更少的梭桿菌門；在科水平上，U_FAE組的擬桿菌科和雙歧桿菌科的相對(duì)豐度比N_FAE組高，而腸桿菌科的相對(duì)豐度則低。此外，U_XOS組與U_Y組的不同之處在于雙歧桿菌科和Selenomonadaceae的豐度增加，而毛螺菌科和梭桿菌科的豐度減少。
（5）識(shí)別不同豐度的分類群 如圖5A所示，G_Roseburia、G_Fusicatenibacter、G_Lachnospiraceae_ND3007_group、G_Butyricimonas、G_Eubacterium_halli_group、G_Oscillibacter、g_Lachnospiraceae_UCG-010、g_Bilophila、g_Turicibacter和g_Lachnospiraceae_FCS020_group的相對(duì)豐度在N_FAE組較高，而o_Lactobacillales在U_FAE組較高。如圖6A和6C所示， G_Eubacterium_halli_group、g_Lachnospiraceae_ND3007_group、g_Bilophila、g_Turicibacter和g_Butyricimonas的豐度在N_FAE組較高（P < 0.05），而g_Bifidobacterium、g_Lactobacillus和g_Lactococcus的豐度在U_FAE組較高，但差異不明顯。如圖5B所示，U_Y組中g(shù)_Lachnoclostridium、g_norank_f_Lachnospiraceae和g_Flavonifractor的豐度比U_XOS組高。如圖6B和6D所示， U_XOS組中g(shù)_Roseburia、g_Fusicatenibacter、g_Bifidobacterium和g_Lactobacillus的含量更豐富，而g_Oscillibacter、g_Bilophila和g_Lachnospiraceae_UCG-010的含量較低，但差異不大。此外，在U_XOS組和U_Y組中沒有檢測(cè)到g_Turicibacter，這意味著它不能在發(fā)酵環(huán)境中被培養(yǎng)。
（6）四組中每個(gè)樣品的頂級(jí)物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹 如圖7A所示，構(gòu)建了一個(gè)層次聚類樹來說明微生物群的組成，并顯示每個(gè)樣品的聚類關(guān)系，發(fā)現(xiàn)N_FAE、U_FAE、U_Y和U_XOS組的樣本分離得很好；如圖7B所示，屬水平的群落熱圖分析顯示了四個(gè)組的前20個(gè)類群和差異豐度類群，如g_Roseburia和g_Bifidobacterium。此外，通過群落熱圖畫出系統(tǒng)發(fā)育樹來說明前20個(gè)物種的進(jìn)化關(guān)系。
試驗(yàn)結(jié)論 本研究招募了5名臨床緩解期的UC患者和5名健康志愿者，對(duì)比兩者腸道微生物群的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在主坐標(biāo)分析（PCoA）和主成分分析（PCA）中，UC患者的糞便樣本與健康志愿者的糞便樣本有差異；健康志愿者的g_Roseburia和g_Lachnospiraceae_ND3007_組的相對(duì)豐度高于UC患者，而o_Lactobacillales的豐度呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（P<0.05）；健康志愿者中g(shù)_Eubacterium_halli_group和g_Lachnospiraceae_ND3007_group的豐度高于UC患者（P<0.05）。此外，在UC患者中， XOS發(fā)酵促進(jìn)了包括g_Roseburia、g_Bifidobacterium和g_Lactobacillus在內(nèi)的細(xì)菌組的生長，這對(duì)腸道疾病的恢復(fù)有益。以上結(jié)果表明，XOS可以緩解臨床緩解期UC患者糞便中的菌群失調(diào)，因此是一種潛在的維持緩解期的益生元。
參考資料： Zongwei Li, Zhengpeng Li, Liying Zhu, et al. Effects of Xylo-Oligosaccharide on the Gut Microbiota of Patients With Ulcerative Colitis in Clinical Remission[J]. Frontiers in Nutrition, 2021, 8: 778542. |
