試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以C57BL/6為背景的野生型（WT）和Il10-/-小鼠（8周齡）作為研究對(duì)象，將雄性野生型（WT）小鼠被分配到WT組，Il10-/-小鼠被分別分配到白細(xì)胞介素-10基因缺陷（IL-KO）組和XOS組，每組有6-8只8周齡的小鼠，XOS組的小鼠接受1.0g/kg/天的95% XOS（由河南益常青生物科技有限公司提供）灌胃，持續(xù)4周后，將小鼠安樂死，收集其組織。 結(jié)腸炎的評(píng)估：XOS干預(yù)期間，每周測(cè)量小鼠體重和疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）的變化；收集結(jié)腸組織，用尺子測(cè)量；對(duì)用蘇木精和伊紅（H&E）染色的結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，每只小鼠0-4分，所有評(píng)分納入相應(yīng)組的統(tǒng)計(jì)。 生化指標(biāo)測(cè)定：測(cè)定結(jié)腸組織中的髓過氧化物酶活性、血清細(xì)胞因子IL-6、C-反應(yīng)蛋白（CRP）和紅細(xì)胞沉降率（ESR）；測(cè)量TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-17A的結(jié)腸信使RNA水平。 評(píng)價(jià)粘液細(xì)菌的滲透：基于每個(gè)樣品的整個(gè)腸道橫截面的觀察，使用熒光原位雜交法對(duì)DNA染色的切片進(jìn)行盲評(píng)的，分?jǐn)?shù)0-4；統(tǒng)計(jì)結(jié)腸隱窩中的細(xì)菌數(shù)量；測(cè)量結(jié)腸黏液的厚度。 杯狀細(xì)胞的數(shù)量以及膜腔面積的測(cè)定：計(jì)算杯狀細(xì)胞的數(shù)量；測(cè)量小泡細(xì)胞的粘液填充面積。 免疫印跡：將結(jié)腸組織均質(zhì)化，在4℃下以15000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，使用ImageJ軟件進(jìn)行量化，結(jié)果與GAPDH歸一化，并以目標(biāo)蛋白表達(dá)/GAPDH表達(dá)比率計(jì)算。 肝臟和腎臟功能的測(cè)定：測(cè)定小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、肌酐和尿素氮。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）XOS干預(yù)改善了Il10-/-小鼠的自發(fā)性結(jié)腸炎 如圖1A-C所示，WT組和IL-10-KO組的小鼠體重差異從第2周開始升高，在第4周有顯著差異；測(cè)量小鼠結(jié)腸組織發(fā)現(xiàn)IL-10-KO組小鼠結(jié)腸明顯縮短，4周的XOS干預(yù)改善了生長(zhǎng)緩慢和結(jié)腸縮短的情況；圖1D顯示，在DAI方面，Il10-/-小鼠的得分隨著時(shí)間的推移逐漸增加，且與WT小鼠相比更高，表明有明顯的結(jié)腸炎；圖1E顯示，組織學(xué)上，Il10-/-小鼠出現(xiàn)了明顯的腸道炎癥，粘膜上有零星的免疫細(xì)胞堆積，腸腺結(jié)構(gòu)受損；圖1F顯示，Il10-/-小鼠的炎癥評(píng)分明顯高于WT小鼠，XOS組的Il10-/-小鼠有明顯的輕度結(jié)腸炎癥，炎癥評(píng)分較低，并伴有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腺體結(jié)構(gòu)損傷。
（2）XOS干預(yù)改善了中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子表達(dá) 如圖2A所示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的MPO濃度更高，XOS干預(yù)后MPO濃度顯著降低；圖2B-E顯示，與IL-10-KO組相比，XOS組小鼠的TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-17A的表達(dá)水平更低；圖2F-H顯示， Il10-/小鼠血液中的IL-6、ESR和CRP水平在第8周至第12周顯著增加，而在XOS干預(yù)組中增加不明顯。
（3）XOS干預(yù)改善了Il10-/-小鼠的粘液細(xì)菌滲透情況 如圖3A所示，在WT小鼠中，細(xì)菌處于在內(nèi)層粘液層之外，微生物群在內(nèi)層粘液層和腔內(nèi)糞便內(nèi)容物之間形成一個(gè)線性結(jié)構(gòu)夾層；Il10-/-小鼠的細(xì)菌與上皮細(xì)胞直接接觸，其中一些細(xì)菌位于隱窩深處，這表明細(xì)菌的滲透發(fā)生在腸結(jié)腸炎發(fā)生的早期，在XOS的干預(yù)下，細(xì)菌的滲透得到了明顯的改善；圖3B-D的結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Il10-/-小鼠的隱窩表面和底部有更多的細(xì)菌定植，而XOS干預(yù)可以減少細(xì)菌的定植。
（4）XOS干預(yù)調(diào)節(jié)了Il10-/-小鼠的粘液屏障 如圖4A和圖4B所示，三組中所有小鼠的粘液層和杯狀細(xì)胞的厚度相似；圖4C結(jié)果顯示，在Il10-/-小鼠中，粘液填充的杯狀細(xì)胞膜面積減少；圖4D對(duì)WT小鼠組織的評(píng)估顯示，上皮細(xì)胞表面有明顯的粉紅色染色（中性碳水化合物）（可能是分泌的粘液蛋白），而杯狀細(xì)胞內(nèi)有明顯的藍(lán)色染色（酸性碳水化合物），相反，Il10-/-小鼠的組織顯示出粘蛋白染色的顯著變化，整個(gè)組織呈深藍(lán)色/紫色，表明中性和酸性粘蛋白的分布和表達(dá)模式發(fā)生了變化。以上說明XOS的作用不僅影響了杯狀細(xì)胞的數(shù)量，而且還顯著改善了粘液填充的杯狀細(xì)胞膜面積，且在XOS干預(yù)后，WT型小鼠Il10 - / -小鼠的PAS/AB染色變化得到改善。
（5）XOS干預(yù)恢復(fù)了Il10-/-小鼠的自噬功能 如圖5所示，免疫印跡結(jié)果顯示，在Il10-/-小鼠中，LC3-II蛋白和LC3-II/I的表達(dá)都明顯減少，p62和beclin-1的表達(dá)增加。經(jīng)XOS處理后的Il10-/-小鼠恢復(fù)了上述變化，說明XOS干預(yù)恢復(fù)了Il10-/-小鼠的自噬功能。
（6）XOS干預(yù)的安全性 如圖6所示，小鼠每天口服灌胃1.0g/kg 95% XOS耐受性良好，沒有觀察到明顯的宏觀不良反應(yīng)，每組的肝腎功能在基礎(chǔ)和干預(yù)后都沒有明顯的變化。
試驗(yàn)結(jié)論 本文通過研究XOS干預(yù)對(duì)Il10-/-小鼠（IBD模型）的影響，結(jié)果表明XOS干預(yù)的Il10-/-小鼠呈現(xiàn)出明顯的輕度自發(fā)性結(jié)腸炎，疾病活動(dòng)指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分和腸道炎癥細(xì)胞因子水平較低；飲食中的XOS降低了在腸道結(jié)腸炎發(fā)病早期的腸道粘液的細(xì)菌滲透率；XOS的作用與結(jié)腸中LC3II/I的表達(dá)回復(fù)和p62及beclin-1的表達(dá)減少有關(guān)。因此XOS降低了結(jié)腸粘液微生物群的滲透，并恢復(fù)了自噬的功能，表明XOS可能是一種潛在的膳食補(bǔ)充劑或功能食品，可用于IBD的早期管理。
參考資料： Chen Z, Shen X, Zhou Q; et al. Dietary xylo-oligosaccharide ameliorates colonic mucus microbiota penetration with restored autophagy in interleukin-10 gene-deficient mice.[J].JPEN. Journal of parenteral and enteral nutrition,2021,Vol.46(5): 1130-1140. |
