試驗(yàn)?zāi)康?/span> 本研究旨在探討甘露寡糖(MOS)和低聚木糖(XOS)兩種益生元對腸炎沙門氏菌感染雞的盲腸菌群和細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 試驗(yàn)設(shè)計 選取150只新孵商業(yè)肉仔雞，隨機(jī)分為5組（每組6個重復(fù)，每個重復(fù)5只）：(1)NC組：未受感染對照組（無病雞飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼糧），(2)PC組：感染對照組（病雞飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼糧），(3)XOS組：感染+XOS（病雞飼喂添加有2 g/kg XOS的標(biāo)準(zhǔn)飼糧），(4)MOS組：感染+MOS（病雞飼喂添加有1 g/kg MOS的標(biāo)準(zhǔn)飼糧），(5)VIRG組：感染+維吉尼亞霉素（病雞飼喂添加有16.5 g/t維吉尼亞霉素的標(biāo)準(zhǔn)飼糧）。 試驗(yàn)共計5d。XOS純度為95%，聚合度(DP)為2~7。 本研究采用從中國獸醫(yī)菌種采集中心獲得的一株具有新生霉素耐藥性的腸炎沙門氏菌(CVCC3378)感染肉雞。QPCR分析用引物如表1所示。
（1）感染后盲腸腸炎沙門氏菌計數(shù) 如圖1所示，取每只肉雞含內(nèi)容物的盲腸均質(zhì)，并在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定接種腸炎沙門氏菌的種群數(shù)量。未感染組盲腸未發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌菌落。感染后第1天，各組間無顯著差異。然而，在感染后第3天，與PC組相比，MOS組的雞腸沙門氏菌數(shù)量減少了1.25 log。感染后第5天，MOS組和XOS組腸炎沙門氏菌的平均計數(shù)分別顯著低于PC組1.62和1.01 log。在任何采樣時間，VIRG處理均未顯著影響腸炎沙門氏菌的定殖。
（2）盲腸微生物群落分析 如表2所示，從90份盲腸標(biāo)本中共獲得16S rRNA V1-V3區(qū)序列955877條。剔除低質(zhì)量和嵌合序列后，保留843947條序列用于下游分析。每個樣本保留的平均讀數(shù)為9377個(±3094個標(biāo)準(zhǔn)偏差(STD))，所有樣本的中位讀數(shù)長度為482個(±86 STD)堿基。去除低豐度OTUs(<總OTUs 的0.005%)后，還剩下4742個OTUs供進(jìn)一步分析。通過計算Chao1指數(shù)、PD(整樹)和觀察到的OTU數(shù)量來評估下采樣(4000 reads)OTU表的α多樣性。腸炎沙門氏菌的定殖和飼糧添加均未顯著改變盲腸菌群α多樣性指數(shù)。 為了估計盲腸微生物群落之間的β多樣性，使用了加權(quán)和未加權(quán)的UniFrac距離矩陣。未加權(quán)UniFrac的ANOSIM顯示，飼糧添加和腸炎沙門氏菌感染沒有相關(guān)性。相比之下，當(dāng)考慮類群的相對豐度(加權(quán)UniFrac距離矩陣)時，在感染后第3天和第5天，各組之間觀察到顯著(P<0.01)但微弱(0.1<R<0.5)的視覺分離(表3和圖2)。采用LEfSe方法檢測各組間差異最大的受影響類群(LDA>2)組之間。未感染組(NC)瘤胃球菌、糞球菌和毛螺菌科的相對豐度分別為15.8%、20.1%和8.2%，高于PC組(0.5%、0.4%和5%)(圖3A)。 將所有感染組進(jìn)行比較，LEFSe顯示，飼喂XOS的肉雞中乳酸菌屬(30% vs 10%)、薔薇菌屬(0.15% vs 0.04%)和梭狀芽孢菌屬(0.32% vs 0.07%)增加，而飼喂MOS的肉雞中瘤胃球菌屬(3% vs 0.5%)、糞球菌屬(0.9% vs 0.01%)和腸球菌屬(2% vs 0.02%)物種增加(圖3B)。VIRG處理不影響盲腸細(xì)菌群的相對豐度。
（3）盲腸集合淋巴樣組織細(xì)胞因子基因表達(dá) 如圖4所示，為了確定腸炎沙門氏菌感染或飼糧處理是否改變了腸道免疫功能，我們使用qPCR方法評估了各種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)。接種PBS或腸炎沙門氏菌一天后，NC對照組的白介素6 (IL-6)、脂多糖誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α因子(LITAF)、干擾素(IFN)-γ和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的相對表達(dá)顯著低于PC對照組(圖4A)。在感染后1天，與PC組相比，飼喂XOS、MOS或VIRG顯著降低了促炎細(xì)胞因子、IL-6和LITAF的表達(dá)(圖4A)；同時，IL-10在VIRG中表達(dá)明顯增加，而XOS組表達(dá)減少。在感染后1天和3天，與PC組相比，MOS處理(而非XOS)顯著降低了IFN-γ的表達(dá)(圖4A和B)。感染后第3天，與IFN-γ相似，LITAF的相對表達(dá)量在MOS組中降低，而在XOS組中沒有降低(圖4B)。腸炎沙門氏菌感染后第3、5天，飼糧添加組間IL-6、IL-10、TGF-β表達(dá)水平無顯著變化(圖4B、C)。
（4）盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)與炎癥反應(yīng)的多因素分析 為了進(jìn)一步研究盲腸菌群與宿主免疫應(yīng)答之間的相互作用，我們采用CCA方法，在屬水平上研究細(xì)胞因子基因(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β)相對表達(dá)與盲腸細(xì)菌組成之間的多元結(jié)構(gòu)。DCA的結(jié)果表明，采用CCA的單峰模型是直接梯度分析的合適排序方法。CCA結(jié)果顯示，不同組盲腸樣本中宿主盲腸炎癥反應(yīng)(IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ、TGF-β)與細(xì)菌組成均有較強(qiáng)相關(guān)性(表4、圖5)。IL-6、IL-10、LITAF、IFN-γ和TGF-β的相對表達(dá)量與細(xì)菌組成在屬水平上一致。IL-10的作用最顯著，其次是IFN-γ、IL- 6、LITAF和TGF-β基因。蒙特卡羅排列檢驗(yàn)表明，宿主盲腸炎癥反應(yīng)與細(xì)菌組成在屬水平上存在顯著相關(guān)(P=0.032)。
試驗(yàn)結(jié)論 綜上所述， XOS益生元降低了病原菌的盲腸定植和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對雛雞腸炎沙門氏菌具有保護(hù)作用。
參考文獻(xiàn)： Mohsen·Pourabedin/Pourabedin M;Qiaoling·Chen/Chen Q;MingMing·Yang/Yang M;Xin·Zhao/Zhao X.Mannan- and xylooligosaccharides modulate caecal microbiota and expression of inflammatory-related cytokines and reduce caecal Salmonella Enteritidis colonisation in young chickens.[J].FEMS microbiology ecology,2017,Vol.93(1). |
