 試驗(yàn)設(shè)計(jì) β-乳球蛋白糖基化產(chǎn)物的制備：準(zhǔn)確稱取若干份相同質(zhì)量β-LG樣品，調(diào)節(jié)低聚木糖和β-LG的質(zhì)量比依次為2：1，4：1，6：1，8：1，10：1；溶于一定濃度的pH值為7.3的PBS緩沖液中，控制水浴溫度55℃，處理時(shí)間8 h的條件下進(jìn)行反應(yīng)，冰浴10 min終止反應(yīng)，4℃儲(chǔ)存，備用。未加入低聚木糖的β-LG同處理做對(duì)照。 β-乳球蛋白糖基化反應(yīng)程度的測(cè)定：取0.125 mL糖基化溶液，加入5 mL質(zhì)量濃度為0. 1 g/100 mL的SDS溶液，渦旋振蕩混勻，從中取0.250 mL加入到盛有2 mL PBS緩沖液（濃度0.05 mol/L，pH值為8.2）的試管中，再加入1 mL質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL的TNBS溶液，渦旋振蕩混勻，在50℃水浴中避光反應(yīng)1 h，然后取出加入2 mL濃度為0.1 mol/L的HCI終止反應(yīng)，室溫下放置30 min，于340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按公式計(jì)算接枝度：DG/%=(A0-At)/A0x100，式中：A0為接枝反應(yīng)前樣品的吸光度；At為反應(yīng)t時(shí)刻后樣品的吸光度。 接枝物褐變度的測(cè)定：取0.125 mL糖基化后溶液，加入5 mL質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的SDS溶液，渦旋振蕩混勻在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以0.1 g/100 mL SDS溶液做空白對(duì)照。 糖基化產(chǎn)物的功能性質(zhì)的測(cè)定： (1)溶解度的測(cè)定：取等量糖基化β-乳球蛋白產(chǎn)物用濃HCI或濃NaOH將溶液的pH值調(diào)配為3.0，5.0，7.0，9.0，然后將樣品于15000 g下離心15 min；在上清液中蛋白質(zhì)的含量以牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行測(cè)定；溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量與總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比；所有實(shí)驗(yàn)操作均在室溫下進(jìn)行。 (2)乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定：取5 mL糖基化產(chǎn)物分別溶于pH值為3.0，5.0，7.0和9.0磷酸鹽緩沖液，加入5 mL玉米油，用數(shù)字均質(zhì)儀在24000 r/min下均質(zhì)1 min后，立即取50 μL底部的乳化液用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液按1：100的體積比稀釋，5 s渦旋后，在500 nm處測(cè)稀釋后的乳化液的吸光度。乳化性用吸光值表示，乳化穩(wěn)定性(ES)為ES=10A0/(A0-A10)式中：A0和A10分別是在0 min和10 min時(shí)測(cè)得的稀釋后的乳化液的吸光度，所有操作至少3次。 (3)起泡性測(cè)定：取30 mL的糖基化產(chǎn)物溶液，在室溫下于均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，然后快速地移至100 mL量筒內(nèi)，記錄泡沫的體積表示為起泡能力，該操作平行5次。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）蛋白接枝度 由圖1可知，在加熱溫度、時(shí)間及pH值大小等其他因素相同時(shí)，隨著低聚木糖與β-乳球蛋白比例升高，接枝度和褐變度都呈先升高后降低的趨勢(shì)，在6：1時(shí)的接枝度最大，達(dá)到28.1%，此結(jié)果表明了6：1比例的糖基化反應(yīng)中糖基化程度最高，糖基的結(jié)合度最大并驗(yàn)證了不同配比的糖基化反應(yīng)中糖基與β-乳球蛋白的結(jié)合。
由圖2可知，在質(zhì)量比為2：1，4：1，6：1，8：1，10：1的糖蛋白比例時(shí)，pH值分別為3.0，5.0，7.0，9.0時(shí)的溶解度都呈先減小再增大的趨勢(shì)；在pH值為5附近的溶解度最小。隨著低聚木糖質(zhì)量比例的增加，修飾后β-乳球蛋白的溶解度有增加的趨勢(shì)，普遍都比未被修飾的β-乳球蛋白溶解度高；當(dāng)?shù)途勰咎桥cβ-乳球蛋白的糖蛋白配比為8：1時(shí)，修飾后蛋白溶解度已經(jīng)得到明顯的提高，糖蛋白比例繼續(xù)增加到10：1時(shí)溶解度的改善程度變化不大。  由圖3和圖4可知，當(dāng)糖的比例逐漸增加時(shí)，糖基化產(chǎn)物的乳化性是先升高后降低，結(jié)果表明蛋白質(zhì)和還原糖的質(zhì)量比直接影響了糖基化反應(yīng)的進(jìn)程；β-乳球蛋白與低聚木糖質(zhì)量比例為6∶1時(shí)候乳化性及乳化穩(wěn)定性最好，乳化性比對(duì)照組β-乳球蛋白高出40.2%。
由圖5可知，低聚木糖的糖基化修飾對(duì)β-乳球蛋白的起泡性能有促進(jìn)作用，是因?yàn)榕菽男纬傻淖钪匾囊蛩厥堑鞍踪|(zhì)的吸附率，促進(jìn)蛋白質(zhì)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，使得吸附率增加，所以β-乳球蛋白泡沫性能略有增加；但是在其他條件相同的情況下，糖基化反應(yīng)中的低聚木糖和β-乳球蛋白配比對(duì)起泡性并無(wú)顯著影響。
總之，本文使用低聚木糖修飾β-乳球蛋白研究β-乳球蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6：1糖蛋白配比時(shí)，β-乳球蛋白和低聚木糖的糖基化反應(yīng)接枝度最高為28.1%；10：1的糖蛋白配比時(shí)，改善β-乳球蛋白的溶解性最好，相比于天然β-乳球蛋白溶解性最大提高了71.4%；6：1的糖蛋白配比時(shí)，改善β-乳球蛋白的乳化性及穩(wěn)定性最好，乳化性比天然β-乳球蛋白高出40.2%，但是糖蛋白配比對(duì)起泡能力并無(wú)顯著影響。 涂越，劉偉，鐘俊楨，劉成梅，徐雨佳. 低聚木糖修飾對(duì)牛乳β-乳球蛋白功能性質(zhì)的影響[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40(12)：12-15. |
