試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試劑和飲食：低聚木糖；木二糖（X2）；木三糖（X3）；木四糖（X4）；木五糖（X5）；四種半純化飲食；低脂飲食（LFD）、高脂飲食（HFD）、含5%XOS的HFD（LXD）和含10%XOS的HFD（HXD），飲食組成見表1。
XOS成分的分析：使用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）對(duì)XOS的組成進(jìn)行鑒定和定量；HPLC分析發(fā)現(xiàn)，XOS主要由56%的X2、42%的X3和2%的X4組成（圖1）。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選擇36只雄性C57BL/6J小鼠（8周齡，體重=20-21克），經(jīng)過一周的適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠隨機(jī)分為四組（每組9只），分別喂食四種食物中的一種，即LFD、HFD、LXD和HXD，為期12周；將小鼠安置在塑料籠子里（每個(gè)籠子3只），溫度為23℃，光暗周期為12/12小時(shí)，每2天給予小鼠新鮮的食物，并允許小鼠自由地獲得食物和水；每2天記錄一次食物消耗量，每3周測(cè)量一次體重，在第12周收集糞便；在第12周結(jié)束時(shí)，所有的小鼠禁食12小時(shí)，在異氟烷吸入麻醉后處死，通過心臟穿刺獲得血樣，放入含有肝素的試管，取出器官，稱重并保存在-80℃以備進(jìn)一步分析。 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）：在第0、3、6、9和12周末，小鼠禁食6小時(shí)，口服2 g/kg體重的葡萄糖，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）；用便攜式血糖儀在0、30、60、90和120分鐘測(cè)定尾靜脈血的血糖水平，繪制葡萄糖濃度-時(shí)間曲線以檢測(cè)血糖水平的變化，并計(jì)算OGTT的曲線下面積（AUC）。 血漿脂質(zhì)組學(xué)分析：在100 μL血漿樣品中加入300 μL甲醇和1 mL甲基叔丁基醚（MTBE）進(jìn)行代謝物提??；在12000 rpm下離心10分鐘后，收集上清液并轉(zhuǎn)移到小瓶中進(jìn)行分析。 糞便中16S rRNA基因的測(cè)序分析：使用QIAamp® DNA Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）提取糞便樣品中的細(xì)菌總DNA；使用Nano-Drop 1000分光光度計(jì)（Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE）檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量和數(shù)量；使用商業(yè)正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和反向引物806R（5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′）對(duì)V3-V4區(qū)域的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增子用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）進(jìn)行純化，并用QuantiFluor?ST（Promega, USA）進(jìn)行定量；測(cè)序工作在上海邁瑞生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。使用Trimmomatic v0.33對(duì)微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；使用UPARSE對(duì)相似度為97%的操作分類單位（OTU）進(jìn)行聚類，使用UCHIME識(shí)別并刪除嵌合序列；用RDP分類器算法對(duì)照Silva（SSU123）16S rRNA數(shù)據(jù)庫，用70%的置信度閾值分析每個(gè)16S rRNA基因序列的分類學(xué)。通過計(jì)算Chao 1和Shannon指數(shù)評(píng)估Alpha多樣性；測(cè)序深度的合理性和效率用稀疏分析來確定。Beta多樣性通過計(jì)算未加權(quán)UniFrac距離并通過原理坐標(biāo)分析（PCoA）圖進(jìn)行可視化評(píng)估，并通過層次聚類分析來呈現(xiàn)微生物群落之間的差異。通過線性判別分析效應(yīng)大?。?/span>LEfSe）來區(qū)分四組中的關(guān)鍵屬種，線性判別分析（LDA）顯著性閾值≥4.0，數(shù)據(jù)在Majorbio I-Sanger云平臺(tái)（www.i-sanger.com）的免費(fèi)在線平臺(tái)上進(jìn)行分析。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）補(bǔ)充XOS對(duì)身體和器官重量的影響 由表2可知，四組小鼠之間在食物攝入和能量消耗方面沒有明顯的差異，盡管開始時(shí)所有組別都使用了體重相近的小鼠，但12周后，HFD組的小鼠的體重明顯高于LFD組；用HFD喂養(yǎng)的小鼠平均體重比正常咀嚼飲食的小鼠高36.86%，表明高脂飲食能夠誘導(dǎo)肥胖癥，且與HFD組相比，LXD和HXD組小鼠的平均體重明顯較輕；LXD組和HXD組小鼠的平均體重分別比HFD組小鼠的平均體重低12.22%和26.33%；各組小鼠的心臟、腎臟和睪丸等器官的重量沒有明顯差異，但HFD組小鼠的肝臟重量比HXD組重24.88%，說明XOS可以減少肝臟中的脂質(zhì)沉積；HFD組小鼠的附睪脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪重量比HXD組高51.00%、59.63%和67.77%，表明XOS能夠影響身體的脂質(zhì)代謝。
（2）補(bǔ)充XOS對(duì)葡萄糖耐量的影響 如圖2所示，喂食不同飲食前所有組別的小鼠在血液中顯示出類似的反應(yīng)，在口服葡萄糖后30分鐘出現(xiàn)峰值，且各組之間的葡萄糖AUC和空腹血糖水平?jīng)]有明顯差異，而用不同的飲食喂養(yǎng)12周后，差異顯著；HFD組的小鼠在口服葡萄糖后30分鐘的血糖水平比HXD的高24.20%，表明葡萄糖耐量受損，此外，與HXD組相比，HFD組的葡萄糖AUC顯著升高。  （3）補(bǔ)充XOS對(duì)血漿代謝物的影響 如圖3A所示，PLS-DA模型分析的數(shù)據(jù)顯示，LFD、HFD、LXD和HXD組的小鼠產(chǎn)生的這些代謝物落在不同的區(qū)域（R2Y=0.648，Q2=0.283）；OPLS-DA分析顯示，與LFD（R2Y=0.849，Q2=0.3）（圖3B和D）和HXD（R2Y=0.968，Q2=0.731）組相比，HFD組小鼠的血漿代謝模式明顯改變。
由表3可知，在有或沒有XOS的情況下，用高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠血漿中31種脂質(zhì)的比例發(fā)生了明顯的變化，這些脂質(zhì)分子屬于神經(jīng)酰胺、甘油一酸酯、二酰甘油、甘油磷脂、甘油磷酸甘油酯和神經(jīng)鞘磷脂類，且這種變化與XOS的劑量有關(guān)；HFD中XOS的補(bǔ)充主要降低了某些脂質(zhì)的含量，降低幅度為2-6倍，盡管與HFD組相比，在HXD組也觀察到一些脂質(zhì)水平的增加。
（4）XOS對(duì)腸道微生物群的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集新鮮糞便樣本，從24個(gè)樣本中共獲得1337157條細(xì)菌16S rDNA基因V3-V4區(qū)的高質(zhì)量序列，序列的平均讀數(shù)為55715，范圍為33689至74444；所有的序列被聚類為502個(gè)OTU，相似度為97%。圖4A顯示，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，喂食HXD的小鼠比喂食HFD的小鼠的Chao 1指數(shù)顯著下降，表明10%的XOS補(bǔ)充導(dǎo)致微生物群落的豐富度下降；圖4B顯示，相比之下，LXD和HXD與HFD相比沒有改變Shannon指數(shù)，表明飲食中XOS的補(bǔ)充沒有改變微生物群落的多樣性；圖4C顯示，基于Unweighted UniFarc原理坐標(biāo)分析（PCoA）的β多樣性分析表明，LFD、HFD和兩個(gè)XOS處理組之間的腸道微生物群有明顯的集群；此外，圖4D顯示，分級(jí)聚類分析的結(jié)果可以將XOS組與LFD和HFD組明確分開。
如圖5A所示，在HFD組中，與LFD組相比，厚壁菌門的豐度和厚壁菌門與擬桿菌門的比例（F/B）有所增加，而補(bǔ)充XOS則部分逆轉(zhuǎn)了高脂引起的變化；圖5B顯示，在科水平上，與LFD相比，HFD降低了雙歧桿菌的豐度，而HXD可以逆轉(zhuǎn)HFD引起的影響。此外，在HFD中補(bǔ)充10%的XOS也可以增加Lachnospiraceae的豐度。為了確定在屬水平上對(duì)4種試驗(yàn)飲食反應(yīng)不同的特定細(xì)菌系統(tǒng)類型，采用了LEfSe分析，以4作為LDA得分的閾值，圖5C顯示，與HFD組相比，觀察到雙歧桿菌、Lachnospiraceae_NK4A136_組和Roseburia在HXD組的豐度明顯增加，綜上所述，結(jié)果表明，補(bǔ)充XOS可以調(diào)節(jié)HFD飲食下小鼠的腸道菌群變化。
試驗(yàn)結(jié)論 本研究結(jié)合血漿代謝譜和腸道微生物群分析，研究了XOS在小鼠中的抗肥胖活性和可能的機(jī)制，研究結(jié)果表明，在飲食中補(bǔ)充5%和10%的XOS可以顯著減緩體重的增加并改善葡萄糖不耐受；脂質(zhì)組分析顯示，血漿中的31種代謝分子，特別是神經(jīng)酰胺和二酰甘油的種類發(fā)生了變化，這與XOS的補(bǔ)充有關(guān)。此外，腸道微生物群分析顯示，XOS改變了腸道微生物群的組成，使雙歧桿菌屬、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Roseburia的相對(duì)數(shù)量增加，總之，補(bǔ)充XOS可以減少肥胖癥的發(fā)展，改善葡萄糖耐受不良，并改變血漿脂質(zhì)譜和腸道微生物群組成。 參考資料： Zhang C ,Abdo A A A ,Kaddour B , et al.Xylan-oligosaccharides ameliorate high fat diet induced obesity and glucose intolerance and modulate plasma lipid profile and gut microbiota in mice[J].Journal of Functional Foods,2020,64103622-103622. |
