試驗(yàn)設(shè)計(jì) 細(xì)菌黏附能力的測定： ①XOS、細(xì)菌、細(xì)胞共孵育黏附試驗(yàn)：在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種IPEC-J2細(xì)胞，置于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約90%時(shí)，更換培養(yǎng)基，加入PBS洗滌三次后的處于對(duì)數(shù)生長期的鼠傷寒沙門氏菌菌液（1×109 CFU/mL，MOI=100），同時(shí)在培養(yǎng)基中加入XOS至終濃度為20 mg/mL，對(duì)照組加入等體積PBS，37℃孵育1 h后PBS洗滌三次以去除未黏附的細(xì)菌，加入1 mL 1%Triton-100常溫30 min裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液充分吹打混勻后進(jìn)行倍比稀釋，通過瓊脂平板倒板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算黏附細(xì)菌總數(shù)量。 ②XOS預(yù)處理細(xì)菌、細(xì)胞黏附試驗(yàn)：黏附試驗(yàn)方法同上，鼠傷寒沙門氏菌與IPEC-J2細(xì)胞均用20 mg/mL XOS進(jìn)行預(yù)處理，處理方法如下：細(xì)菌預(yù)處理：在細(xì)菌培養(yǎng)過程中加入終濃度為20 mg/mL的XOS溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，置于37℃空氣搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，進(jìn)行后續(xù)處理；細(xì)胞預(yù)處理：待12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長至約80%時(shí)，棄培養(yǎng)基并用PBS洗滌細(xì)胞一次，加入新鮮培養(yǎng)基，并加入終濃度為20 mg/mL的XOS溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，輕搖混勻后置于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約90%時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理。 qRT-PCR：培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌并用20 mg/mL XOS對(duì)菌液進(jìn)行處理，對(duì)照組加入等體積PBS，待細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，通過BIOG細(xì)菌RNA提取試劑盒提取鼠傷寒沙門氏菌總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，采用如表1所示體系進(jìn)行qRT-PCR，以鼠傷寒沙門氏菌DNA消旋酶亞基基因gyrA（DNA gyrase subunit A）作為內(nèi)參，對(duì)獲得的信號(hào)、數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的比值以反映其表達(dá)豐度，引物信息見表2。  pH測定：培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌并添加20 mg/mL XOS溶液，置于37℃空氣搖床220 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測定一次細(xì)菌培養(yǎng)液的pH，測定前將菌液進(jìn)行離心以分離菌體與培養(yǎng)液。 Mg2+濃度測定：培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌并添加20 mg/mL XOS溶液，置于37℃空氣搖床220 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測定一次培養(yǎng)液中的Mg2+濃度，離心后通過鎂濃度檢測試劑盒（微量法）測定Mg2+濃度。 試驗(yàn)結(jié)果 （1）XOS共孵育對(duì)鼠傷寒沙門氏菌黏附IPEC-J2細(xì)胞的影響 由圖1可知，與未加XOS組相比，XOS共孵育能夠極顯著（P<0.01）抑制鼠傷寒沙門氏菌對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附，在共孵育處理體系中，XOS、鼠傷寒沙門氏菌和IPEC-J2細(xì)胞三者同時(shí)存在，表明XOS能通過影響鼠傷寒沙門氏菌與IPEC-J2細(xì)胞之間的互作來抑制其對(duì)細(xì)胞的黏附作用。
（2）XOS預(yù)處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌黏附IPEC-J2細(xì)胞的影響 由圖2可知，與未加XOS組相比，XOS預(yù)處理的鼠傷寒沙門氏菌對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力顯著降低（P<0.01）；XOS預(yù)處理IPEC-J2細(xì)胞組雖然未達(dá)到顯著性（P>0.05），但是黏附細(xì)菌數(shù)量在數(shù)值上有一定的降低；另外設(shè)置共孵育處理組，結(jié)果與（1）相同，表明除了參與細(xì)菌與細(xì)胞間的互作外，XOS還能夠通過影響鼠傷寒沙門氏菌本身從而抑制其對(duì)細(xì)胞的黏附能力。
（3）XOS對(duì)鼠傷寒沙門氏菌黏附素基因表達(dá)的影響 由圖3可知，通過基因篩選，我們發(fā)現(xiàn)XOS極顯著（P<0.01）下調(diào)了鼠傷寒沙門氏菌黏附素STM0306基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量（無顯著性變化的基因結(jié)果未展示），表明XOS可能通過影響鼠傷寒沙門氏菌STM0306基因表達(dá)進(jìn)而影響其的黏附能力。
（4）XOS對(duì)鼠傷寒沙門氏菌pH值的影響 由圖4可知，XOS處理組的pH在2 h和4 h均顯著（P<0.05）低于未加XOS組。
（5）XOS對(duì)鼠傷寒沙門氏菌Mg2+濃度的影響 由圖5可知，XOS處理組培養(yǎng)基中的Mg2+濃度在2~6 h均低于對(duì)照組，且在4 h達(dá)到了顯著性（P<0.05），表明XOS可能通過影響細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境的pH值和Mg2+濃度調(diào)控PhoP/PhoQ雙組份系統(tǒng)的活性，進(jìn)而影響下游STM0306基因的表達(dá)。
試驗(yàn)結(jié)論 以IPEC-J2細(xì)胞為模型，探究了XOS對(duì)鼠傷寒沙門氏菌黏附能力的影響和黏附素STM0306基因表達(dá)的調(diào)控效果及機(jī)制，結(jié)果表明，XOS顯著降低了鼠傷寒沙門氏菌對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力（P<0.05）；qRT-PCR結(jié)果表明，XOS處理導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌黏附素基因STM0306表達(dá)量極顯著降低（P<0.01）；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，XOS處理后鼠傷寒沙門氏菌培養(yǎng)基的pH值顯著降低（P<0.05），Mg2+濃度顯著提高（P<0.05）；結(jié)果顯示，XOS可能通過調(diào)控菌液的Mg2+濃度在一定程度上抑制鼠傷寒沙門氏菌PhoP/PhoQ調(diào)控系統(tǒng)，進(jìn)而抑制其下游基因STM0306表達(dá)，從而降低細(xì)菌對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力。 參考資料： 凌翀,于曉蕾,曹慶云等.低聚木糖下調(diào)鼠傷寒沙門氏菌STM0306基因表達(dá)并抑制其黏附能力的作用[J/OL].飼料工業(yè):1-13. |
